黄芩苷体外抗IBV QX株的作用研究

为研究黄芩苷体外抗禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)QX株的效果，试验对IBV进行复壮与扩繁，制备原代鸡胚肾(CEK)细胞，并测定IBV对CEK细胞的TCID₅₀和黄芩苷对CEK细胞的最大无毒浓度(MNTC);在MNTC基础上采用CCK法测定不同浓度黄芩苷对IBV的有效抑制率，观察不同浓度黄芩苷对IBV导致的CEK细胞的细胞病变效应(CPE)的抑制情况，并采用qPCR法测定不同浓度黄芩苷对IBV N基因相对表达量的影响。结果表明：成功复壮并扩繁了IBV,其未被其他病毒污染，对CEK细胞的TCID₅₀为1×10^-4.75/0.1 mL;黄芩苷对CEK细胞的MNTC为9.75 mg/L;该浓度黄芩苷对IBV的有效抑制率最高，为64.03%,能有效减轻IBV对CEK细胞的CPE;各浓度黄芩苷均可以极显著降低CEK细胞中IBV N基因相对表达量(P<0.01)。说明黄芩苷对CEK细胞的MNTC为9.75 mg/L,该浓度黄芩苷具有较好的体外抗IBV QX株的...     

连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素-6的影响

试验旨在研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中炎症因子白介素-6(IL-6)水平的影响,将1日龄雏鸡正常饲养至50日龄时,心脏采血处死,表面消毒后,剖检分离鸡脾脏,用脾淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞,将脾淋巴细胞共分为20个组,具体为4个剂量组×5个时间点=20个组。4个剂量组分别为:对照组、LPS组(5μg/m L)、连翘酯苷A低剂量预防组(5μg/m L LPS+200μg/m L连翘酯苷A)、连翘酯苷A高剂量预防组(5μg/m L LPS+400μg/m L连翘酯苷A)。5个时间点分别为:0、6、12、24、48 h,经内毒素和连翘酯苷A处理不同剂量和不同时间后,收集脾淋巴细胞,通过采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测脾淋巴细胞中IL-6水平。ELISA结果显示:与对照组相比,LPS组脾淋巴细胞中炎症因子IL-6蛋白含量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A不同剂量预防组脾淋巴细胞中IL-6蛋白含量均下降,表明脾脏中IL-6蛋白含量的变化与连翘酯苷A的剂量呈正相关性,通过抑制LPS诱导的鸡脾脏中IL-6蛋白含量的升高,可减轻炎症反应。q RT-PCR结果显示:与对照组相比,LPS组脾淋巴细胞中IL-6 mRNA表达量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A不同剂量预防组脾淋巴细胞中IL-6 mRNA表达量均下降,IL-6 mRNA表达量与连翘酯苷A的剂量呈负相关性,试验表明连翘酯苷A可以通过转录水平抑制LPS诱导的鸡脾淋巴细胞中IL-6 mRNA表达量的升高,减轻炎症反应。结果表明,连翘酯苷A抑制鸡脾淋巴细胞中IL-6水平,对免疫功能有一定免疫影响,具有抗炎功能。     

连翘酯苷A对内毒素致鸡脾淋巴细胞白介素-1β的影响

试验旨在研究内毒素和连翘酯苷A对鸡脾淋巴细胞中白介素-1β(IL-1β)水平的影响,将1日龄雏鸡常规饲养至50日龄时,心脏采血处死后,无菌剖检取脾,并用鸡脾淋巴细胞分离液将鸡脾淋巴细胞分为20个组,具体为5个时间点×4个剂量组=20个组。作用时间分别为0、6、12、24和48 h,作用剂量组分别为对照组、内毒素(LPS)组(5μg/m L)、连翘酯苷A预防低剂量组(5μg/m L LPS+200μg/m L连翘酯苷A)和连翘酯苷A预防高剂量组(5μg/m L LPS+400μg/m L连翘酯苷A)。按上述方法培养后,收集鸡脾淋巴细胞,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测鸡脾淋巴细胞中IL-1β水平。ELISA结果显示:与对照组相比,LPS组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量下降,并与连翘酯苷A添加剂量呈正相关。qRT-PCR结果显示:与对照组相比,LPS组鸡脾淋巴细胞中IL-1βmRNA表达量升高;与LPS组相比,连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1βmRNA表达量下降,并呈剂量时间效应。试验表明LPS可以诱导鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量升高,而连翘酯苷A预防组鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量下降,表明连翘酯苷A可以通过转录和翻译途径抑制LPS诱导的鸡脾淋巴细胞中IL-1β蛋白含量和mRNA表达量的升高,减轻炎症反应,发挥抗炎功能。     

左旋咪唑对鸡离体外周血淋巴细胞的作用

本文报道了左旋咪唑对鸡离体外周血淋巴细胞（PBL）增殖及伴刀豆球蛋白A（ConA)诱导细胞（CIC）活性的作用；左旋咪唑以剂量依赖性方式促进鸡PBL的增殖；与ConA对促进鸡PBL增殖呈现协同作用；对脂多糖（LPS）激活鸡PBL具有明显促增殖作用；可逆转磷酸组胺和肾上腺素对ConA和LPS激活鸡PBL增殖的抑制作用；低浓度左旋咪唑不能逆转氢化可的松对ConA激活鸡PBL增殖的抑制作用，但高浓度（100-400μg/ml）可明显逆转氢化可的松的抑制作用；左旋咪唑可明显逆转氢化可的松的对LPS激活鸡PBL增殖的抑制作用；可促进CD4^ 细胞增殖，抑制CD8^ 细胞增殖，使CD4^ /CD8^ 细胞比值升高，CIC活性增强。     

连翘酯苷对小鼠的急性毒性及体内诱生IFN-α的研究

测定连翘酯苷对小鼠腹腔注射急性毒性试验的半数致死量(LD50),检测连翘酯苷体内诱生干扰素的效果.腹腔注射连翘酯苷,用改良寇氏法计算半数致死量.眼部采血,ELISA方法测定血清中IFN-α.测得连翘酯苷对小鼠腹腔注射急性毒性的LD50为1 976.5 mg/kg,LD50的95%可信限为1 863.7 mg/kg～2 096.1 mg/kg.连翘酯苷诱生干扰素在48 h达到最高峰845.8 pg/mL±150.92 pg/mL(P＜0.01).表明连翘酯苷为低毒化合物,体内能够诱生IFN-α.     

连翘叶中7种成分的抗氧化活性研究

试验旨在筛选出连翘叶抗氧化的主要药效物质，探讨其抗氧化的作用效果。采用化学法、过氧化氢诱导巨噬细胞RAW264.7损伤模型，以清除DPPH自由基、ABTS自由基、·O2-自由基和细胞抗氧化酶活力为指标，综合评价连翘叶中7种成分的抗氧化活性。结果显示，连翘叶中连翘酯苷A (FSA)、连翘酯苷B (FSB)、连翘酯苷H (FSH)和连翘酯苷I (FSI)成分对DPPH自由基、ABTS自由基、·O2-自由基均具有较好的清除能力。FSA、FSB、FSH和FSI可提高过氧化氢诱导的巨噬细胞RAW264.7中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性，提高还原性谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量，改善过氧化氢诱导的细胞氧化损伤。经热图分析及主成分分析，发现FSA、FSB、FSH、FSI 4种苯乙醇苷类成分与抗氧化能力呈正相关。研究表明，连翘叶中的FSA、FSB、FSH、FSI 4种苯乙醇苷类成分具有较好的抗氧化活性，是连翘叶发挥抗氧化活性的主要药效物质。     

减蛋综合征病毒AA-2株适应体外培养的研究

在分离并系统鉴定了减蛋综合症病毒AA-2株的基础上，进行了该毒株的体外培养试验，以寻求适应于细胞培养物中继代的细胞适应毒。结果表明，AA-2毒株可在鸭胚成纤维细胞（DEF）、鸭胚肾细胞（DEK）、鸭胚肝细胞（DEL）、鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肾细胞（CEK）和鸡胚肝细胞（CEL）上增殖和继代，并随着继代次数的增加，CPE潜伏期缩短，持续期延长，半数细胞感染量（TCID50）呈逐代增加趋势，血凝效价（HA）逐代稳步增强，至第15代之后，之些变化趋于稳定。证明用鸭胚细胞培养的AA-2株病毒在PK-15，BHK-21，SP2/0等细胞中增殖的迹象。还较为系统的测定了第19代DEF毒的其它特性。发现在接毒后120小时，HA及TCID50值最高，细胞适应毒对鸭胚致死率为10%，比原毒降低23%，理化特性与原毒一致，且仍保持原毒的抗原性。     

连翘酯苷-羟丙基-β-环糊精包合物制备及其特性

针对连翘酯苷稳定性较差,限制了药物制剂制备及临床应用的问题,采用环糊精包合技术研制连翘酯苷注射剂,利用研磨法制备连翘酯苷-羟丙基-β-环糊精包合物.表征分析表明包合物光谱和熔点发生变化,对光稳定性和热加速实验稳定性明显增加.高效液相色谱分析鸡静脉注射给药血药浓度,表明连翘酯苷包合物与连翘酯苷药物动力学差异较小,血液中包合态药物能较快发生脱包合作用.     

荧光定量PCR方法检测IBV病毒在CEK细胞中的动态变化

为揭示鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在鸡胚肾细胞（CEK）中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3～12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。     

荧光定量PCR方法检测IBV病毒在CEK多细胞中的动态变化

为揭示鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在鸡胚肾细胞（CEK）中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3～12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。     

Development of a Cell Culture Method for Quantal Assay of Strain I-2 of Newcastle Disease Virus

Repeated titrations of strains of Newcastle disease virus (NDV) are more conveniently undertaken in cell cultures rather than in embryonated eggs. This is relatively easy with mesogenic and velogenic strains that are cytopathic to various cell lines, but is difficult with avirulent Australian isolates that are poorly cytopathic. Strain V4 for example has been shown to be pathogenic iin vitro only to of chicken embryo liver cells. Strain I-2 was reported to produce cytopathic effect (CPE) on chicken embryo kidney (CEK) cells. The present studies confirmed this observation and developed a quantal assay. CEK cells infected with strain I-2 developed CPE characterized by degeneration, rounding, granularity and vacuolation, and the formation of synctia. End points were readily established by microscopic examination of fixed and stained cells. In virus infectivity studies on strain I-2, where multiple titrations are required and where large numbers of samples are used, titration using CEK cell grown in microtitre plates is recommended. Such studies may not be feasible in embryonated eggs.     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。     

高效液相色谱法检测羊鸡组织中氟苯达唑、噻苯达唑及其代谢物残留量的研究

建立了一种可同时检测羊组织（肌肉、肝脏、肾脏、脂肪）、鸡组织（肌肉、肝脏）中氟苯达唑及代谢物2-氨基氟苯达唑、噻苯达唑及代谢物5-羟基噻苯达唑药物残留的高效液相色谱检测方法。结果表明：氟苯达唑及代谢物2-氨基氟苯达唑、噻苯达唑及代谢物5-羟基噻苯达唑在0.02～1.5μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系r,均大于0.999。方法的定量限为20μg/kg。在鸡组织（肌肉、肝脏）中,两种药物及其代谢物在20～800μg/kg的添加浓度范围内,其回收率范围在60%～100%之间;在羊组织（肌肉、肝脏、肾脏、脂肪）中,两种药物及其代谢物在20～200μg/kg的添加浓度范围内,其回收率范围在60%～100%之间;批内变异系数均小于15%、批间变异系数均小于20%。     

紫花地丁黄酮类提取物体外抗传染性支气管炎病毒作用研究

为了在体外研究紫花地丁黄酮类提取物抗鸡传染性支气管炎病毒（IBV—M41）的作用,以鸡胚肾细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应（CPE）与空斑减数试验测定紫花地丁黄酮类提取物抗IBV活性,计算其IC50与治疗指数,并从药物对病毒的直接灭活作用、对病毒吸附的影响及对病毒穿膜的影响3个方面初探紫花地丁黄酮类提取物抗IBV活性的机理。结果：紫花地丁黄酮类提取物能明显抑制IBV的致病变作用,其IC50为16．52mg／L,TI值为15．76。研究显示,紫花地丁黄酮类提取物在体外对IBV直接灭活的效果明显,在高浓度时对抑制IBV吸附与穿入细胞具有一定作用。结果表明：紫花地丁黄酮类提取物在体外有明显的抗IBV感染作用,且主要是通过直接灭活IBV而发挥作用。     

喹胺醇与鸡血浆蛋白结合的初步研究

采用平衡透析法结合反相高效液相色谱法（RP—HPLC）测定鸡血浆中喹胺醇的蛋白结合率。色谱条件为ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（250mm×4．6mm,5μm）,流动相为乙腈：水（40：60,v／v）,流速1．0mL／min,检测波长352nm。结果显示,喹胺醇浓度为1．1、5．5、22．0μg／mL缓冲液中鸡血浆的蛋白结合率分别为84．41％、75．30％、66．96％;透析平衡时间约为30h。表明喹胺醇的鸡血浆蛋白结合率较高,药物浓度与血浆蛋白结合率之间呈反比关系。     

连翘酯苷脂质体在雏鸡体内的药动学研究

The study was aimed to evaluate the pharmacokinetics and tissue distribution of forsythiaside liposome in chicks by intravenous administration. The pharmacokinetics of chicks with intravenous administration of forsythiaside liposome and forsythiaside solution 20 mg/kg was studied and the concentrations of forsythiaside in heart, liver, spleen, lung, kidney and plasma were determined by HPLC. The plasma concentration-time curves of forsythiaside liposome and forsythiaside solution were both fit to the two-compartment model and the pharmacokinetic parameters were (1.79±0.050) and （0.11±0.006） h for t_1/2β, (39.95±2.32） and (4.26±0.39) (μg·h)/mL for AUC, (0.56±0.04） and （4.73±0.41） mg/(h·kg) for CLs. Compared with the liposome to the solution, the drug distribution in liver, spleen and lung were obviously elevated. Compared with forsythiaside solution, the forsythiaside liposome could significantly prolong the resident time of forsythiaside in the blood circulating system and could be concentrated at the target tissue rich in the reticuloendothelial system.     

金银花提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒研究

通过观察金银花提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的Marc-145细胞的保护效果、对病毒感染滴度(TCID50)的影响及对ORF7mRNA表达的影响来评价其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。结果表明,金银花提取物大孔树脂600mL/L的乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞具有较好的保护效果,最小保护浓度为6.25μg/mL。6.25μg/mL 600mL/L的乙醇/水洗脱部位使PRRSV病毒滴度从105.8 TCID50降低至100.3 TCID50左右,使PRRSV ORF7mRNA含量降低1 000多倍。因此,金银花提取物大孔树脂600mL/L的乙醇/水洗脱部位具有良好的体外抗PRRSV活性。     

黄芩苷、连翘酯苷对肺微血管内皮细胞分泌IFN-α、IFN-γ的影响

为了研究黄芩苷、连翘酯苷对大鼠肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）分泌IFN-α、IFN-γ的影响,本试验以体外培养的PMVECs为模型,用ELISA法检测这2种中药成分在不同浓度、不同时间点诱导PMVECs分泌IFN-α和IFN-γ的量。结果表明,黄芩苷在10 μg/mL,24 h时诱导PMVECs分泌的IFN-α和IFN-γ的量均最高,连翘酯苷分别在20 μg/mL、12 h时和5 μg/mL、24 h时诱导PMVECs分泌的IFN-α和IFN-γ的量最高。这一结果为体外筛选诱导PMVECs表达干扰素的中药成分提供了参考,为进一步研究中药成分的抗病毒机理奠定了基础。     

芪蓝四君子汤对雏鸡小肠IgA分泌细胞和SIgA(分泌型IgA)的影响

雏鸡在新城疫La Sota系冻干苗进行口腔免疫时,分别按0.125,0.250,0.500 g/mL 3个剂量灌服芪蓝四君子汤1 mL,连续10 d。于20,40,60日龄时剖杀摘取各段肠管,免疫组织化学方法检测十二指肠、空肠、Peyer's斑单位面积IgA分泌细胞的变化,同时通过ELISA方法测定空肠中SIgA的含量。结果表明,与对照组相比,芪蓝四君子汤能显著提高雏鸡小肠IgA分泌细胞的阳性表达率及空肠SIgA抗体水平,揭示芪蓝四君子汤能提高新城疫的免疫原性,增强雏鸡的黏膜免疫力,是有效的口服佐剂。     

超高效液相色谱法同时测定鸡肝中五种氟喹诺酮类药物残留

建立了一种同时测定鸡肝中五种氟喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱法(UPLC)。样品经磷酸盐缓冲溶液提取、C18柱净化,采用ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1mm,1.7μm)分离,以乙腈溶液和0.1%甲酸的水溶液作为流动相进行等度洗脱,荧光检测器检测。五种药物在0.005~0.5μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r均大于0.999;以0.05、0.15、0.30μg/g三个浓度水平进行添加回收试验,平均回收率为70.2%~98.2%,相对标准偏差为4.6%~12.1%,方法的检出限(LOD)为0.02μg/g,定量限(LOQ)为0.05μg/g。本方法重现性好、灵敏度高、简单、快捷,适用于鸡肝中五种氟喹诺酮类药物多残留的检测。