双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ,试验方法的最佳工作条件为：抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１：２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体,脑和肺的检出率最高,其次为心,肝,脾,肾等组织。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol·L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达.通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性.以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原的最佳包被量为3.74 μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50.用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%.     

猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法并进行相应优化,研制出了猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,并与国内市场标杆产品进行比较,发现阳性符合率为88.03%,阴性符合率为91.47%,总体符合率达到89.84%。同时,该试剂盒批间、批内变异系数均小于10%,具有较好的重复性。该检测试剂盒的研制,可为猪场猪伪狂犬病毒野毒感染的检测提供技术支撑。     

猪伪狂犬病病毒gE 37～243蛋白的原核表达及gE蛋白抗体间接ELISA的建立

gE蛋白是鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染和gE基因缺失疫苗免疫的首选靶标.本研究利用大肠杆菌表达系统获得了可溶性表达的gE37～243蛋白,并以纯化的gE37～243蛋白为包被抗原建立了检测PRV gE抗体的间接ELISA方法.结果 显示,该方法的敏感性和特异性分别为93.33％和93.75％,批内和批间变异系数...     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

三种ELISA方法与荧光抗体病毒中和试验检测狂犬病抗体的一致性分析

为筛选合适狂犬病抗体检测的试剂盒,该研究以荧光抗体病毒中和试验（fluorescent antibody virus neutralization FAVN）方法为参照,与3个ELISA试剂盒方法进行比对,进行一致性分析,并计算了三种试剂盒的敏感性和特异性。结果显示：三种不同的试剂盒中,试剂盒A与FAVN一致性最好,Kappa值为0.605,有较高的一致性,符合率为86%;试剂盒B次之,Kappa值为0.485,为中度一致,符合率为80%;试剂盒C与FAVN的一致性最差,Kappa值为0.310,符合率也最低,为74%。在敏感性和特异性方面,试剂盒A的敏感性最高,为92.1%,试剂盒B的特异性最高,为72.7%。本研究为临床上科学的筛选试剂盒提供了依据。     

间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体

用猪肾传代细胞IBRS－2增殖猪伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株，病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇（Mr20000）浓缩后作为包被抗原。用纯化的猪血清IgG免疫家兔，HRP村记撮的兔抗猪IgG，制备出高效价的酶标抗体，酶标抗体工作浓度为1：50000；经各种条件的选择，建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为39.2mg/L，血清最佳稀释度为1：20，与猪细小病毒、猪、O型口蹄疫、猪衣原体标准阳性血清呈阴性反应，与标准阴性血清和临床未感染PRV的猪血清呈阴性反应；与猪伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应；与美国进口的PRV抗体检测ELISA诊断试剂盒检测结果比较，45份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100％。表明建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于猪伪狂犬病血清抗体的定性和定量检测。     

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为,抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高,其次为心、肝、脾、肾等组织。     

间接ELISA快速检测猪PRV抗体方法的建立

用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化伪狂犬病病毒(PRV)作抗原,建立了检测PRV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为3.2 mg/L,血清最佳稀释度为1∶80。试验结果表明,间接ELISA检测PRV抗体具有快速、敏感、特异等特点,适合于大量样品的检测,对畜群免疫效果的检测和免疫程序的制定有重要意义。     

间接ELISA法对禽霍乱抗体的动态监测

将40只50日龄健康禽霍乱非免疫鸡随机分为四组,每组10只。用禽霍乱蜂胶佐剂灭活疫苗对各组鸡进行不同水平的免疫,同时设非免疫对照组。各组鸡间隔5-7天采血,以间接ELISA法测定血清P／N值,并确定临界值。将P／N值在2.1-4.7的13只试验鸡以一个最小致死量（相当于10个菌／ml）进行攻毒试验,同时设攻毒对照,在1周内3只对照鸡均表现感染发病并死亡,而试验鸡均健活,从而初步证明所确定的临界值是合理的。     

狂犬病毒G蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

目前狂犬病疫苗的效力检验采用NIH法,需要使用狂犬病毒CVS-24毒株进行攻毒试验,具有一定的生物安全风险。为寻求替代NIH法中脑内攻毒试验的方法,研究扩增狂犬病毒G蛋白基因,并将其克隆至大肠杆菌pET-32a载体上进行表达,以该蛋白作包被抗原,摸索试验条件,建立了检测小鼠血清抗体效价的间接ELISA方法。使用此方法与国际公认的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法比较,两者检测结果曲线相关系数为0.986,表明相关性较好,但ELSIA方法更加快捷、简便。本试验建立的间接ELISA方法可用于检测小鼠血清中狂犬病抗体,为狂犬病毒血清抗体测定和单克隆抗体筛选提供依据。     

间接ELISA检测抗传染性法氏囊病病毒抗体方法的建立

采用原核表达的传染性法氏囊病毒(IBDV)核衣壳蛋白VP2作为诊断抗原,建立检测IBD血清抗体的间接ELISA方法.抗原最佳包被量为每孔174.67ng,待检血清最佳稀释度为1:40,待检血清样品的D492nm≥0.43Dpos+0.57Dneg判为阳性,反之判为阴性.对采自安徽省部分地区的979鸡血清样品进行检测,IBDV抗体阳性率为39.73%.结果证实,间接ELISA法用于IBDV血清抗体的监测具有良好的特异性,是一种快速简便的血清学方法,值得在基层推广应用.     

犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

用狂犬病毒单克隆抗体预包被酶标板,将纯化的狂犬病毒作为检测用抗原,利用捕获包被法建立了间接ELISA法用于犬狂犬病病毒抗体的检测。通过优化ELISA条件,研制试剂盒并应用于犬狂犬疫苗的免疫效果检验。利用研制的试剂盒与RFFIT、商品化同类试剂盒对30份犬血清进行平行检测,总符合率分别为90%和93.33%,与其它几种常见犬病毒抗体阳性血清无交叉反应。试剂盒批内、批间变异系数分别为1.45%～5.79%和2.35%～7.21%,2～8℃保存12个月稳定。基于用单抗预包被后再包被检测抗原,本试剂盒检测样品抗体的灵敏度和稳定性得以显著提高,因此适合于不同来源狂犬疫苗人工免疫犬血清的RV抗体水平监测。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法。应用该方法检测鸡痘阳性血清，其灵敏度为琼脂扩散试验的400～800倍，而且还具有特异性强、操作简便、快速等特点。     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

Development and Optimization of Indirect ELISA Detection Method of Classical Swine Fever Virus Antibody

In this study,through a series of screening and optimization of reactions condition,an indirect ELISA method was developed for detections the antibodies against classical swine fever virus (CSFV) with the purified recombinant CSFV E2 protein.The results showed that the optimal concentration for coating antigen was 1.0 μg/mL and incubated at 37 ℃ for 1 h.The proper serum sample was diluted by 1:200 and the sealing time was 37 ℃ for 1 h.Enzyme labeled second antibody was diluted by 1:10 000 and the reaction time was 45 min incubating at 37 ℃.The D450 nm<0.30 of sample defined as negative of CSFV antibody in the serum sample.The intra-batch and inter-batch variation coefficients were 4.8% and 6.9%,respectively.It indicated that the method in this study had a high stability.Specific test showed that the indirect ELISA had no crossing reactions with the antibodies against PRV,PRRSV,PCV and PPV.80 serum samples were detected in this study,the positive coincidence rate of indirect ELISA was 83.58%,the negative coincidence rate was 76.92%,and the total coincidence rate was 80.25% compared to the results of import blocking ELISA kit.The results suggested that the established indirect ELISA method in this study had an excellent clinical application.     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA方法的建立及应用

应用纯化的EMCV VP1重组蛋白建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最佳工作条件。结果表明,重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.54μg/mL;与间接免疫荧光试验比较,结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。此方法中VP1抗原最佳稀释度为1:100,待检血清的最佳稀释度为1:50,酶标二抗的最佳稀释度为1:800,1%明胶为封闭液,OD450时阴阳性血清的临界值为0.35。对2006年天津7个地区66个猪场295份屠宰猪的血清样本的检测结果显示,天津各地区血清EMCV抗体阳性率在41.67%～93.33%之间,平均84.75%,猪场抗体阳性率在50%～100%,平均93.94%。     

ELISA法检测非洲猪瘟抗体实验条件的优化

本文以灭活非洲猪瘟病毒为包被抗原,分析了包被浓度、酶标二抗、显色底物对ELISA法检测非洲猪瘟抗体的影响,以期获得最适反应条件。以2个阳性血清和一个阴性血清为待检样品,用不同包被浓度、2种酶标二抗和2种显色底物进行ELISA反应,记录吸光值,分析阴阳性样品吸光值差异,优化阴性样品背景值,计算P/N值。结果表明,包被浓度为15μg/mL、二抗为HRP标记蛋白A、显色底物为OPD时,两个阳性样品P/N值分别为4.920和7.259,为本方法的最适反应条件。