棉花细菌人工染色体文库构建的方法优化

以我国抗病、优质、丰产的棉花优良品种中棉所12号为材料,对棉花细菌人工染色体(BAC)文库构建过程中的一些关键技术,如plug的制备、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入片段与载体的摩尔比值、连接产物的浓缩等进行了研究,建立了构建棉花BAC文库的适宜方法体系。依照该方法初步构建了含有38000个克隆的棉花BAC文库。经检测,插入片段平均大小约为120kb,蓝斑率小于0.5%,空载率小于1%。插入片段与载体的最适摩尔比为1∶15,一次转化可以获得约2000个克隆,cfu·μl 1高达4。该方法为进一步构建中棉所12号多倍基因组的BAC文库、从而进行棉花基因组有关研究奠定了基础。     

甘蓝基因组细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体（ BAC）文库是克隆甘蓝抗病优质重要基因的基础,以抗枯萎病、富含硫代葡萄糖苷的结球甘蓝自交系R4P1为材料,美国Epicentre公司的CopyControl TM pCC1BACTM为载体,构建了甘蓝细菌人工染色体文库。该文库有73344个克隆,插入片段平均大小约97 kb,空载率＜3％,覆盖甘蓝基因组约10．9倍,筛选到甘蓝任一基因的概率为99．99％,这些结果表明,构建的文库质量较好,可用于后续分析。构建的甘蓝BAC文库不仅可用于枯萎病基因的克隆,而且为克隆其他重要的功能基因及基因组学等的研究奠定了基础。     

细菌人工染色体文库及其应用

细菌人工染色体是1992年以来发展起来的一种新型克隆载体，用于构建人、动物、植物核基因组DNA大片段插入文库。细菌人工染色体在文库构建中具有转化效率高、构建文库简单、嵌合体少、插入片段容易回收、在寄主细胞中插入片段稳定性好、插入片段较大等优点。细菌人工染色体文库的构建对于基因组较大的真核生物基因组学研究具有重要作用，该文库可用于真核生物重要性状基因及全基因组的物理作图、重要农艺性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析等研究。本文主要综述了细菌人工染色体文库的构建及其在图位克隆基因、荧光原位杂交、全基因组物理作图等研究中的应用进展。     

云南疣粒野生稻细菌人工染色体（BAC）文库的构建与分析

我国有3种野生稻,即普通野生稻(oryza rufipogon)、药用野生稻(O.officinalis)、疣粒野生稻(O.granulata).野生稻由于长期处于野生状态,经受了各种灾害和不良环境的自然选择,抗逆性较强,是天然的基因库,保持有栽培稻不具有或已经消失了的遗传基因,它在水稻育种中具有独特的作用,是水稻育种的宏厚物质基础.     

陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建

 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体（BAC）文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明, BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。     

雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建

 采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×10⁴ cfu·mL^-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆：F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。     

亚洲棉7号染色体分离及文库构建

 采用前低渗、酶解、后低渗和盖片轻压相结合的方法,建立了激光法分离二倍体亚洲棉石系亚1号单条染色体技术。单染色体经去蛋白、酶切和PCR扩增后,产物以Southern杂交、简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)引物扩增和荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)进行验证,构建了棉花单条染色体文库。克隆片段长度在150~1000 bp,平均为550 bp;文库包含1.38×10⁵个克隆,覆盖染色体长度1倍左右,空载率为1%,滴度为1.3×10⁶ pfu·mL^-1,单一拷贝和低拷贝比例达到59%以上,为该条染色体分子标记的筛选、重要基因克隆和定位、遗传图谱的饱和奠定基础。     

籼稻品种H359基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建

村建能够通过农杆菌介导转化植物的人工染色体文库可以加快突变基因的精细定位和克隆的速度。为了克隆水稻突变基因的需要，我们利用pYLTAC7载体构建了籼稻品种H359基因组的TAC文库。该文库包含41088个克隆，保存在107块384孔板中。插入片段大小在50—100kb之间，平均插入大小为77kb，推测该库覆盖水稻基因组接近7．4倍。     

基因表达文库的构建及其方法分析

基因表达文库构建和筛选技术是80年代初发展起来的用于筛选和克隆基因的基本手段.表达文库中含有大量基因表达信息, 使其成为广大实验室优先建立的文库之一. 迄今为止, 表达文库的构建方法在传统方法的基础上不断被改善, 针对各种类型的目的基因克隆的要求,可以选择不同的载体和方法来构建适当的基因表达文库.本文详细介绍了多种构建基因表达文库的方法,比较它们的构建方法的优点和不足之处,并对它们在实际应用中的作用作了较为全面的分析.     

长片段小麦细菌人工染色体DNA亚克隆文库的构建

为了加快小麦基因组的测序,以Langdon库中的一个BAC克隆(BAC790O10)为材料,利用HydroShear DNA剪切仪将其打断,产生许多大小不同的DNA随机片段,回收其中3～5 kb的片段,并将这些片段随机克隆入TOPO载体,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.     

棉花多抗病性育种的抗性诱导研究

采用强致病力菌株,制备成棉子菌粉载菌体和孢子悬浮液,研究不同菌量、不同接菌方法和致病温度,诱导棉花苗期抗枯、黄萎病性的育种新技术。通过4种接种剂量梯度试验表明,棉花苗期诱导抗性的最佳接菌量是90 g.m-2棉子菌粉载菌体,播种前土壤接菌,棉黄萎病菌孢子悬浮液的最佳接菌浓度是2×107孢子.ml-1,2片真叶时伤根接菌10 ml,薄膜拱盖提温,20~25℃是诱导发病的最适温度,接菌15~20 d后,淘汰棉枯萎病发病8%以上和棉黄萎病12%以上的品种群体材料,并淘汰抗病群体材料中的感病个体,构建既抗棉枯萎病、又抗棉黄萎病性的多抗病性育种方法。     

棉花纤维RNA提取方法的比较及酵母双杂交文库的构建

为了从棉花纤维中提取高质量的RNA用于构建酵母双杂交文库,采用4种不同的方法提取9天和19天棉花纤维的RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测结果表明：热硼酸法适用于初生幼嫩纤维和次生加厚纤维的RNA提取,CTAB-PVP法仅适用于初生幼嫩纤维的RNA提取,异硫氰酸胍法和高盐高pH值法提取的RNA由于杂质含量较多而影响反转录效果。采用热硼酸法大量提取总RNA,纯化后的mRNA反转录为cDNA,通过重组将扩增的cDNA片段定向插入到pGADT7-Rec AD克隆载体中,得到棉纤维9天和19天的酵母双杂交cDNA文库。2个文库的滴度分别是1.01×107 cfu /mL和8×106 cfu /mL,cDNA插入片段长度集中分布在250~2500 bp之间。由此可以看出,构建的2个棉纤维文库质量较高,可用于棉花纤维素合成和调控途径的研究。     

不同类型棉田昆虫群落调查的抽样方法研究

本研究运用群落生态学的原理与方法，通过种—面积（或样方数）模型的建立与分析及不同抽样面积（或样方数）条件下群落特征参数的比较与分析，探讨了不同类型棉田昆虫群落的抽样方法。结果表明，在昆虫群落调查中，平作棉和麦套棉及两类棉田的不同阶段均可采用相同的抽样方法，样方面积为１ｍ２（正方形）．最小抽样面积为１０ｍ２（或１０个样方），适宜抽样面积为１０～２０ｍ２（或１０～２０个样方），棋盘式取样方法较为理想。     

胚轴切断法诱导棉花对棉铃虫抗性的研究

诱导抗虫棉株对棉铃虫[Helicoverpaarmigera(Hubner)]发生动态的影响表明,在田间累积卵量无明显差异的情况下,胚轴切断结合假单胞杆菌(PseudomonasfluorescensP303-1)诱导处理的棉株上棉铃虫二代、三代、四代幼虫发生量分别比在自然生长棉株上的幼虫量减少44.79％、37.98％和29.70％;而只用胚轴切断法处理的棉株上二代、三代棉铃虫幼虫发生量减少25％和8.53％,四代幼虫发生量与自然生长棉株相近。棉铃虫幼虫在菌诱导棉株和无菌诱导棉株上的死亡率分别是自然生长棉株上的4.7l倍和3.01倍。诱导棉株对棉铃虫幼虫的生长发育亦有影响,菌处理和无菌处理的棉株饲喂棉铃虫幼虫,其发育历期分别比对照延长17.17％和7.80％,虫重分别降低25.28％和15.63％,化蛹率分别降低14.94％和9.97％,蛹重分别降低19.80％和8.68％。菌处理和无菌处理后棉株体内多元酚和萜烯类物质均比对照有不同程度的提高,菌处理的增幅要高于无菌处理。     

人工模拟“庇护所”和“非庇护所”条件下棉铃虫对Bt棉的抗性演变

 人工饲料中添加转Bt基因杂交棉品种中棉所29棉仁粉,建立杂交和自交品系分别模拟“庇护所”和“非庇护所”条件,连续多代进行棉铃虫对Bt棉的抗性筛选。结果表明：经11代筛选,棉铃虫自交品系和杂交品系的幼虫死亡率下降,体重和体长增加,幼虫历期缩短,化蛹率和羽化率增加。依据幼虫死亡率、体重、体长、幼虫历期以及化蛹率、羽化率等生命参数的演变,相较杂交品系,自交品系对Bt棉能更快地产生适应性。11代筛选后,利用不同抗性品系棉铃虫进行转基因棉抗虫性评估,结果表明：相比敏感品系,杂交品系测定4个转基因棉品种的抗虫性等级未发生变化,而中棉所29等3个转基因棉品种对棉铃虫自交品系的抗性下降了1个等级。对Bt制剂的抗性测定结果表明,杂交品系的抗性倍数为2.5215,自交品系的抗性倍数为9.3876。据本研究初步结果,利用“庇护所”策略延缓棉铃虫对转Bt基因棉的抗性产生是可行的。     

转Bt基因棉抗棉铃虫鉴定技术及抗性表示方法研究

1997～1998年通过接幼虫和即将孵化的卵,进行转Bt基因棉室内鉴定技术及表示方法研究。结果表明,以接即将孵化的卵粒,4d后观测其取食情况最为简便准确,根据试验结果拟定检测分级标准,提出利用抗虫指数计算各抗虫棉群体抗性,依此可以量化地表示转Bt基因棉的抗虫性。     

利用根箱法解析转双价（Bt + CpTI）基因棉花对土壤微生物数量及细菌多样性的影响

 利用根箱法对棉花根部土壤进行分区采集,并采用传统平板培养和DGGE克隆测序技术相结合的方法,对转双价基因棉和常规棉3个生长时期(播种后40 d、50 d和60 d)不同根区土壤细菌、放线菌和真菌数量及细菌多样性进行对比分析。平板培养结果表明,与常规棉相比,转双价基因棉S1根区土壤细菌、放线菌的数量显著降低,而S2根区土壤细菌、放线菌、真菌和S3根区土壤细菌、真菌的数量显著增加(P＜0.05);DGGE图谱分析表明,在棉花生长的3个时期内,转双价基因棉和常规棉根区土壤细菌多样性指数、均匀度和条带数均无显著差异(P＞0.05),2种棉花处理间有着很强的相似性,不受转双价基因棉种植的影响。转双价基因棉种植仅改变了根区土壤可培养微生物数量,对细菌多样性无显著影响。