福氏志贺菌gyrA和parC基因QRDR序列的测定和同源性分析

测定了我国痢疾流行病原志贺菌福氏2a 301株与喹喏酮类药物耐药性相关的gyrA(DNA旋转酶A亚单位）和parC（拓扑异构酶IVA亚单位）基因，并将gyrA和parC基因QRDR（喹喏酮类药物耐药性决定区）核苷酸序列与几种动物和人的病原菌进行了同源性和遗传进化比较分析，结果显示，志贺菌福氏2a gyrA和parC基因QRDR序旬分别与宋内氏志贺菌菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌K12、阴沟肠杆菌、坂口肠道杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、坂口肠道杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副作寒沙门氏菌，肺炎克氏杆菌、产道氏杆菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎克氏杆菌、产道克氏杆菌、空肠弯曲杆菌、沸氏柠檬酸杆菌具有显著同源性（均大于88％），表明gyrA和parC是这些细菌中的看家基因，推测在各种细菌中具有类似的起源，因此，对在不同细菌之间进行喹喏酮类药物耐药性的研究非常有利。QRDR的遗传进化分析表明，同属或相近属细菌gyrA或parC QRDR的遗传距离明显接近，其中与大肠杆菌属的距离最近，认为可列到同一个性中，结果有力支持了近年提出的大肠杆菌与志贺菌属于同族细菌的理论，研究对理解喹喏酮类药物耐药性的分子机理及其与细菌遗传进货之间的关系具有重要意义。     

鸡和人志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药的关系

通过药敏实验检测了鸡鲍氏、人鲍氏和人福氏三株志贺菌对12种常用抗生素的耐药情况,发现三者均未产生对喹诺酮类药物的耐药性。用聚合酶链反应(PCR)分别扩增三株志贺菌的DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因,并对其中的耐喹诺酮类决定区(QRDR)进行了分析。发现鸡和人鲍氏志贺菌QRDR区的序列没有发生任何碱基突变,这与药敏试验结果相吻合。人福氏志贺菌虽然也对喹诺酮类无耐药性,但其gyrA基因存在83位Ser83(TCG)→Leu(TTG)的突变,由于只有83位点一处突变,所以尚未表现出耐药性表征,parC基因中存在58位Ser58(AGC)→Ile(ATC)的突变,该突变点与常见的80、84位氯基酸的改变有所不同,却仍在QRDR区域之中,虽然暂时还无法根据这一结果判断该突变与喹诺酮类耐药性之间的关系,但至少表明该菌株正处在耐药性演变进程之中,其在志贺菌耐药性中的确切作用还有待进一步研究。     

27株牛源肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因遗传分析

为了解重庆和四川地区牛源肺炎克雷伯菌分离株之间的进化关系,本试验通过PCR方法扩增27株肺炎克雷伯菌gyrA、parC基因并测序,对测序结果进行基因进化分析。结果表明,gyrA、parC基因片段扩增产物大小分别为420,382bp;27株分离株可分成4个大簇,荣昌分离株主要与ha06(中国·江苏)、NCTC11228(荷兰·乌特勒支)等聚类于Ⅰ簇;丰都分离株紧密聚类于Ⅱ簇;Ⅲ簇全为云阳分离株;自贡分离株聚类于Ⅰ、Ⅳ簇。     

福氏志贺菌2a主动外排基因acrA的克隆和分子特征

acrA基因在细菌耐药过程中起重要作用,通过生物信息学方法,结合PCR技术,对福氏志贺菌2a基因进行了克隆。基因序列分析表明,克隆得到的acrA基因ORF由1194个核苷酸组成,编码一个由397个氨基酸组成的多肽,含有一段24个氨基酸的信号肽,预测蛋白质分子量和等电点分别约为42.15ku和8.42。本研究获得的主动外排基因acrA的信息为进一步研究AcrA蛋白的结构与功能奠定了基础。     

豪猪源福氏志贺菌的分离鉴定及喹诺酮类耐药基因检测

为调查四川省某规模化豪猪养殖场中豪猪大面积腹泻死亡的原因,本研究采集病死豪猪的肠道内容物和肺脏等病料样品进行细菌的分离纯化,通过培养特性观察、革兰染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因的克隆测序进行鉴定,并对分离菌株进行致病性、耐药性分析,对其喹诺酮类耐药基因进行PCR检测并测序分析。结果显示,分离得到1株革兰阴性菌,该分离株符合福氏志贺菌的培养特性和生化特性,并且其16S rRNA基因序列与福氏志贺菌该基因序列的同源性为99%;对小鼠具有较强致病性;药敏试验结果显示分离株具有多重耐药性,仅对丁胺卡那敏感,对喹诺酮类、四环素类、头孢类、氨基糖苷类、青霉素类和氯霉素类药物均表现为耐药;分离株的DNA促旋酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ的喹诺酮耐药决定区均有突变,且携带有质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr A和qnr S。本研究是国内首次关于豪猪源福氏志贺菌病的报道,为豪猪养殖中该细菌性疾病的诊断防治等相关研究提供参考。     

福氏志贺菌多重耐药调节蛋白MarA的原核表达

为获得福氏志贺菌多种耐药调节蛋白MarA,将扩增出的marA基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,经PCR和双酶切鉴定以及序列测定,重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,表达的蛋白再经Ni-NTA亲和层析纯化,结果显示,MarA蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,经Western-bloting检测,表达的蛋白能被福氏志贺菌阳性血清特异识别,说明表达蛋白具有良好的免疫反应性。     

鸡源志贺菌16SrRNA基因克隆、测序及同源性分析

目的:建立鸡源志贺菌的16SrDNA序列分析方法从而进一步从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌。方法:用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌16SrRNA的部分基因(16SrDNA)并测序,将所获得的序列与GenBank中人志贺菌序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。结果:首次研究发现鸡源志贺菌的16SrDNA序列与已知的人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99·7%,与人福氏志贺菌的同源性为96·0%。结论:16SrDNA序列分析鉴定志贺菌是一种快速、可靠的方法。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

福氏志贺菌2型外膜蛋白A的原核表达及多克隆抗体的制备

福氏志贺菌外膜蛋白A是细菌入侵宿主细胞的作用蛋白,同时激活机体的免疫机制对抗细菌的感染,在动物疫苗上有很好的应用前景。采用分子克隆方法获得福氏志贺菌OmpA蛋白表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OmpA蛋白,免疫小鼠制备OmpA蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Western blot检测抗血清特异性;DNAMan与MEGA软件分析OmpA蛋白系统进化关系。结果显示,OmpA重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致;ELISA法确认OmpA抗血清滴度达1∶1 600,Western blot证实抗血清具有很好的特异性。OmpA序列系统发生分析发现不同种的致病菌存在同源性,尤其C-端同源性较高,并且不同种志贺菌具有更高的同源性。表明成功制备OmpA蛋白和小鼠多克隆抗体,为OmpA蛋白功能与疫苗开发研究奠定了基础。     

禽源沙门菌gyrA基因多态性的检测与分析

沙门菌是常见的人畜共患病原菌,不仅能导致鸡白痢、禽伤寒和禽类副伤寒等疾病,而且是人类伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎等疾病的病原菌[1].抗生素的应用,对预防和控制沙门菌病发挥了巨大的作用,但是随之产生了耐药性的问题.     

牛源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的检测分析

为研究近年来新疆地区牛源大肠杆菌中质粒介导喹诺酮类药物耐药基因的分布及其对喹诺酮类抗生素的耐药情况,本研究于2016-2018年从新疆石河子、沙湾、奎屯、玛纳斯和伊犁5个地区12个规模化奶牛场分离出116株牛源大肠杆菌,药敏试验检测其耐药性,同时利用PCR扩增PMQR耐药基因。药敏试验结果显示,62.93%的菌株对氨苄西林耐药,耐药率最高。对链霉素、四环素、卡那霉素和恩诺沙星的耐药率依次为56.90%、54.31%、43.10%和42.24%。对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率较低,分别为7.76%和11.21%。分离菌主要携带qnrA、qnrS和aac（6'）-Ⅰb-cr 3种耐药基因;116株大肠杆菌中有31株携带PMQR的耐药基因,检出阳性率为26.72%,其中26株仅携带1种PMQR耐药基因,占所有菌株的22.41%,4株携带2种PMQR耐药基因,占所有菌株的3.45%,1株携带3种PMQR耐药基因,占所有菌株的0.86%。综上所述,新疆地区牛源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类药物基因主要为qnrA、qnrS和aac（6'）-Ⅰb-cr 3种,且对恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星均产生不同程度的耐药性。     

食品动物源沙门氏菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的检测与分析

为了解食品动物源沙门氏菌质粒介导喹诺酮类耐药性(Plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR),采用微量肉汤稀释法和PCR方法,检测了316株食品动物源沙门氏菌对20种抗菌药物的敏感性,以及菌株中PMQR基因的携带率.结果显示:316株沙门氏菌对20种抗菌药物呈不同程度的耐药性,95.57％菌株为多重耐药菌;316株菌中未检出qnrA、qnrC、qnrD、qnrS和qepA基因,7.91％菌株检出qnrB基因,15.19％菌株检出aac(6 ′ )-Ib-cr基因,7.91％菌株检出oqxA基因,8.86％菌株检出oqxB基因,这是首次在沙门氏菌中发现oqxAB基因;98.11％PMQR阳性菌同时携带2种及以上的耐药基因,呈8～17耐的多重耐药性,其中以qnrB和aac(6′)-Ibcr基因型为主;53株PMQR阳性菌分属于5种不同的基因型,耐药表型或耐药基因型不同的菌株却有相同的PFGE谱型.本次检测的316株食品动物源沙门氏菌耐药较为严重;菌株主要携带qnrB、aac(6 ′ )-Ib-cr及oqxAB基因;不同来源菌株存在同一耐药克隆株的流行.     

Clonal Spread of Salmonella enterica Serovar Infantis in Serbia: Acquisition of Mutations in the Topoisomerase Genes gyrA and parC Leads to Increased Resistance to Fluoroquinolones

Quinolone‐resistant Salmonella Infantis (n = 64) isolated from human stool samples, food and poultry during the years 2006–2011 were analysed for their resistance phenotypes, macrorestriction patterns and molecular mechanisms of decreased susceptibility to fluoroquinolones. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of nalidixic acid (NAL) and ciprofloxacin (CIP) were determined by the agar dilution procedure, and the susceptibility to additional antimicrobial agents was determined by the disc diffusion method. To assess the influence of enhanced efflux activity, MICs were determined in the presence and absence of the inhibitor PAβN. The results of pulsed‐field gel electrophoresis (PFGE) typing revealed that quinolone‐resistant S. Infantis in Serbia had similar or indistinguishable PFGE profiles, suggesting a clonal spread. All S. Infantis showed combined resistance to NAL and tetracycline, whereas multiple drug resistance to three or more antibiotic classes was rare (2 isolates of human origin). The MICs ranged between 512 and 1024 μg/mL for NAL and 0.125–2 μg/mL for CIP. A single‐point mutation in the gene gyrA leading to a Ser83→Tyr exchange was detected in all isolates, and a second exchange (Ser80→Arg) in the gene parC was only present in eight S. Infantis isolates exhibiting slightly higher MICs of CIP (2 μg/mL). The inhibitor PAβN decreased the MIC values of CIP by two dilution steps and of NAL by at minimum 3–6 dilution steps, indicating that enhanced efflux plays an important role in quinolone resistance in these isolates. The plasmid‐mediated genes qnr, aac(6′)‐lb‐cr and qepA were not detected by PCR assays.     

Study on Aerotransmission of Escherichia coli Carrying the Plasmid-mediated Quinolone Resistance Genes of Swine

To investigate the aerotransmission of Escherichia coli (E.coli) carrying the plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes,airborne E.coli were isolated from indoor air,upwind air and downwind air samples in five swine farms.Fecal samples from swine houses were randomly collected to isolate the E.coli.The sensitivities of the E.coli strains against 14 antibiotics were tested.The E.coli carrying the PMQR genes (qnr,aac(6')-Ib-cr,qepA) were identified by ERIC-PCR,and then the genetic fingerprints of E.coli were established to analyze its origins and spread toward the outside surroundings.The results showed that E.coli isolated from five swine farms showed high resistance against 12 antibiotics,such as gentamicin,kanamycin,tetracycline,streptomycin,nalidixic acid and sulfamethoxazole,and presented multi-drug resistant.Results of ERIC-PCR showed that 46.34% (19/41) of strains isolated from indoor air samples had the same origin with fecal-obtained strains,and 73.68% (14/19) of them shared the same PMQR genes with fecal-obtained strains.68.42% (26/38) of strains isolated from downwind air samples had the same origin with fecal-obtained or indoor air-obtained strains,and 65.38% (17/26) of them shared the same PMQR genes with fecal-obtained or indoor air-obtained strains.This indicated that E.coli carrying PMQR genes and originating from feces in swine houses could form aerosols to pollute the indoor air and then spread to the downwind air through air exchange (≥400 m),which could be a potential threaten to public environment and human health.     

猪源携带质粒介导喹诺酮类耐药基因大肠杆菌气源性传播的研究

为了调查养猪场携带质粒介导喹诺酮类耐药基因大肠杆菌的气源性传播情况,本试验分别在5个猪场舍内及舍外上风向和下风向不同距离收集空气样品,并在舍内随机采集粪便样品,分离大肠杆菌。药敏试验检测其对14种抗生素的耐药性。以质粒介导喹诺酮类耐药基因(qnr、aac(6')-Ib-cr、qepA)为指示基因,利用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链式反应(ERIC-PCR)鉴定技术,分别对5个猪场不同样品中大肠杆菌的遗传相似性进行分析,评估其向舍外空气的传播情况。结果显示,5个猪场中的大肠杆菌对庆大霉素、卡那霉素、四环素、链霉素、萘啶酸、复方新诺明等12种常用抗生素耐药率较高,且呈现多重耐药。ERIC-PCR结果显示,46.34% (19/41)的舍内空气分离株与粪便分离株来源相同,其中73.68% (14/19)的分离株携带的耐药基因也相同;68.42% (26/38)的舍外空气分离株与舍内空气或粪便分离株来源相同,其中65.38% (17/26)的菌株携带相同的耐药基因。结果表明,起源于舍内粪便的携带质粒介导喹诺酮类耐药基因的大肠杆菌能形成气溶胶污染舍内空气,并借助舍内外气体交换,传播到舍外不同距离空气中(≥400 m),对养殖场周围的环境卫生及社区居民的健康形成威胁。     

致病性沙门菌的耐药表型分析及其耐药基因检测

采用K-B法测定自雏鸡分离的致病性沙门菌对四环素等20种抗生素的耐药情况,并应用PCR方法检测相应的耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE和tetG.结果显示,受试4株菌株全部对四环素、强力霉素高度耐受,在染色体上均有tetA基因存在,其中3株在质粒上还存在tetB基因,耐药表型与耐药基因的检测结果完全相符.表明tetA和tetB基因是决定本试验中临床分离沙门菌株对四环素类抗菌药物耐药的主要原因.     

错配PCR方法快速检测耐FQs沙门氏菌基因突变的初步研究

根据耐药沙门氏菌基因突变位点碱基变化情况,设计合适的引物进行错配PCR,鉴别突变位点,使其结果与测序结果相吻合,以建立错配PCR方法快速检测耐氟喹诺酮类药物沙门氏菌基因突变,判断菌株是否耐药.错配PCR检测方法条件优化成熟之后,对经过测序的菌株进行耐药突变位点的快速检测,检测结果与测序结果符合率高达96%.