灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝(Ganoderma lucidum)金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸(Ser)和丙氨基酸(Ala),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。     

玉米ZmbZIP基因的克隆及表达模式分析

根据玉米碱性亮氨酸拉链(bZIP)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了一个ZmbZIP基因。研究结果表明:ZmbZIP基因cDNA全长1 300 bp,5′-非编码区长180 bp,3′-非编码区长226 bp,编码区长894 bp,编码297个氨基酸,预测分子量为32.4 KDa,等电点为9.39。氨基酸同源性分析发现,ZmbZIP与谷子的bZIP同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmbZIP基因的表达受脱落酸,干旱和高盐胁迫的诱导,不受低温诱导,说明玉米ZmbZIP基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。     

盐芥ThNHX1基因的3′RACE

以盐芥为材料,依据拟南芥AtNHX1基因的序列信息设计引物,扩增出盐芥中ThNHX1基因的部分序列,然后使用快速扩增cDNA3′末端(3′RACE)方法,从盐芥中克隆到ThNHX13′cDNA序列。该序列全长680 bp,编码104个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AtNHX1基因的相应序列同源性分别为91%和91.5%,而盐芥ThNHX1基因3′端非翻译区序列与拟南芥相应序列的同源性为68.5%,明显低于编码区。     

玉米ZmCIPK基因的克隆及表达模式分析

为了克隆玉米逆境胁迫应答基因,根据玉米CIPK基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK基因。结果表明,ZmCIPK基因cDNA全长1 776bp,5′-非编码区长249bp,3′-非编码区长177bp,编码区长1 350bp,编码449个氨基酸,预测分子量为50.64kDa,等电点为9.58。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK与高粱的CIPK同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmCIPK基因的表达受脱落酸、干旱、高盐胁迫和低温诱导,说明玉米ZmCIPK基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

杜仲2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶基因全长cDNA克隆与序列分析

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶(MDS)基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径的一个关键节点。为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析。结果表明:EuMDS基因cDNA全长976 bp,5′端非编码区长119 bp,3′端非编码区长146bp,编码236个氨基酸。推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列(A1~A56)以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点(A84,A87,A89,A121,A213,A217,A221,A223,A228)。推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.3%,β-折叠占13.6%,螺环结构占46.2%。推导EuMDS蛋白三级结构由3个亚单位组成,并相互围绕形成1个分子内腔。系统进化分析表明EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近。预测所克隆的EuMDS基因在杜仲萜类生物合成中发挥重要功能。     

琯溪蜜柚汁胞Beta-tubulin cDNA的克隆及序列分析

以琯溪蜜柚汁胞为材料,采用cDNA克隆方法进行Beta-tubulin cDNA的克隆和表达.结果表明:琯溪蜜柚果肉Beta-tubulin cDNA全长1636 bp,有完整的阅读框,编码444个氨基酸;5′非翻译区60 bp,3′非翻译区243 bp(不包含终止密码子TAA),其中包括1个多聚腺苷酸化信号AATAAA以及1个含21个腺苷酸的poly(A)尾.由琯溪蜜柚果肉Beta-tubulin cDNA推导的氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、杨属植物(Populus)等的同源性较高,分别为86%、85%、84%等.通过构建重组质粒p28-PTU,并转化至Trans Rosetta(DE3)中,在诱导温度为37℃、IPTG浓度为1 mm、诱导时间为4 h的条件下,其在大肠杆菌宿主中获得了表达.     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。     

鸡生长激素cDNA及其5'端调控区的克隆分析

从肉用品种鸡构建的垂体文库中克隆分离了鸡生长激素ｃＤＮＡ,并作了核苷酸序列测定。克隆的鸡生长激素ｃＤＮＡ序列全长为７８９个碱基对,其中５＇非转译区为４０个碱基对,３’非转译区为１０１个碱基对,编码区为６４８个碱基对。通过序列比较分析,克隆的鸡生长激素ｃＤＮＡ序列与已报道的蛋用品种鸡生长激素ｃＤＮＡ序列的同源性为９６％,与鸭生长激素序列的同源性为８７％,但与火鸡生长激素序列的同源性只有５２％。通过ＰＣＲ技术,本研究还扩增了６个鸡品种的生长激素基因５’端调控区。尽管这些鸡品种的生产性能差异显著,但序列分析表明鸡生长激素基因５’端调控区十分保守。因而,鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或３’端侧翼序列的影响。另外,鸡生长激素对多人数量性状的影响也在本文中进行了讨论。     

大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

[目的]探讨重金属对大珠母贝苗种存活的影响。[方法]对大珠母贝金属硫蛋白基因进行克隆和序列分析。[结果]结果表明,通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599 bp,5′UTR（Un-translated region）为75 bp,3′UTR为296 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）为228 bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。[结论]该研究为海洋贝类金属硫蛋白的进化及功能研究提供基础资料。     

元江普通野生稻金属硫蛋白(YJMT-2)的获得及序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库克隆进行随机测序,获得了元江普通野生稻金属硫蛋白(YJMT-2)的cDNA序列。该序列全长为558 bp,5′-端非翻译区为84 bp,3′-端非翻译区为247 bp,开放阅读框长度为225 bp(包括一个终止密码子),可编码74个氨基酸,蛋白分子量为7.51 kD,理论等电点(PI)为6.51,其中含12个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的16.22%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC排列方式,具有植物MT-2的典型特征;经Pfam15.0分析证明,其属于金属硫蛋白家族的成员。BlastP同源性分析,该基因与日本粳稻、大麦的同源性较高,分别为98%和65%。首次得到元江普通野生稻金属硫蛋白基因,为其功能研究提供了基础。     

高山红景天GH3基因克隆及序列分析

参照已知植物GH3的氨基酸序列,通过比较找出相对保守的氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE法得到高山红景天GH3的3'端,其长度838bp,编码200个氨基酸的602 bp位于GH3的开放阅读框内和一段长36bp的3'非编码区(3'UTR).序列比较结果表明,GH3推导的氨基酸序列与已公布的几种植物GH3氨基酸序列有较高的序列同源性.     

赤眼鳟TRAF6基因的cDNA克隆及其应对GCRV的免疫表达特性

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)肿瘤坏死因子受体相关因子6基因的结构特性及其应对GCRV的免疫表达特性,采用RACE技术获得了赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长(共2 621 bp),其中包含5′端非编码区50 bp,开放阅读框1 629 bp,3′端非编码区942 bp;该基因编码542个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量为61670,理论等电点为6.01。SMART结构分析结果显示,TRAF6基因编码的蛋白包含1个RING结构域、2个锌指结构域、1个螺旋卷曲结构域和1个MATH结构域。系统进化树分析结果表明,赤眼鳟TRAF6与团头鲂TRAF6的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,TRAF6在赤眼鳟的12种组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,在中肠中的表达量最低;经GCRV感染后,赤眼鳟脾脏和头肾中TRAF6均呈波动上调趋势,在24 h达到峰值,表明TRAF6参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答反应。     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.