番木瓜果肉果胶裂解酶基因克隆及反义植物表达载体的构建

采用cDNA末端快速扩增方法.获得了番木瓜果肉果胶裂解酶(Pectate lyase,PL)基因的完整3′端和部分5′端序列.然后,根据本实验室已经获得的PL基因5′端DNA序列及笔者得到的3′端序列设计上、下游引物,以番木瓜基因组DNA为模板扩增得到PL基因的开放性阅读框.该序列编码385个氨基酸,与草莓、桃、芒果、拟南芥氨基酸序列的同源性分别为83.38%、75.76%、73.68%、65.96%.根据PL基因设计特异引物,扩增其保守区片段,将其反向插入pBI 121的CaMV 35 S启动子和Nos终止子之间,成功构建反义植物表达载体pBP,并导入到根癌农杆菌EHA 105中.     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

奥默柯达酵母植酸酶基因phy1在毕赤酵母中的表达

将奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)植酸酶基因phy1构建到巴斯德毕赤表达载体pPICZαA中,转入到受体菌X-33中,成功实现了奥默柯达酵母植酸酶基因phy1的分泌表达。利用BMMY培养基进行诱导培养,甲醇诱导3 d后,重组酶产量达到最高,为6 290 U/mL,SDS-PAGE显示重组酶的大小约为62 ku。通过对表达产物的酶学性质研究,发现该重组酶具有较好的热稳定性及较广泛的pH适用范围,其最适作用温度为65℃,最适作用pH为5.0。     

象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶新基因Me-pel2的鉴定及发育表达分析

利用EST结合RACE方法从象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)中克隆一个新的果胶酸裂解酶基因Me-pel2(Gen Bank登录号KP987180)。Me-pel2 c DNA开放阅读框全长834 bp,推导编码277个氨基酸残基的蛋白,属于多糖裂解酶第III家族新成员。Me-PEL2与南方根结线虫果胶酸裂解酶Mi-PEL3氨基酸具有较高的一致性,为54%。发育表达结果显示,Me-pel2在2龄幼虫和雄虫期高丰度表达,而在固着期寄生阶段转录水平急剧下降,推测Me-pel2主要在象耳豆根结线虫迁移性阶段起重要作用,通过降解寄主细胞壁果胶质成分,协助幼虫侵入寄主以及在寄主体内迁移。     

大豆过氧化物酶基因在毕赤酵母中的表达

大豆过氧化物酶(Soybean peroxidase,SBP)是一类主要催化过氧化氢的氧化还原酶,具有耐热性高和 pH 适用范围宽等优点.利用已构建好的重组表达载体pPICZα-A-sbp,通过氯化锂化学转化法将重组质粒转化进入毕赤酵母GS115中,并在甲醇诱导下进行表达.利用SDS-PAGE法和愈创木酚法测定了重组菌株的SBP表达活性.结果显示,重组毕赤酵母表达了分子量约为40 KD的SBP蛋白,同时发酵24 h后SBP表达活性开始迅速增高,发酵72 h SBP表达活性达到最大,并筛选出表达活性高的菌株.     

内生解淀粉芽孢杆菌TB2内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和原核表达分析

以内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株基因组为模板,克隆了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因的ORF.测序结果表明该ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸,分子量为55．07ku,等电点为7．83.Blast同源性分析结果表明,该序列与GenBank登录的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis M28332)纤维素酶核苷酸序列的同源性最高(98％),其氨基酸同源性也达98％,已被GenBank收录(Accession number).用BamH I和Xho I双酶切目的片段和表达载体pET-29a( )后相连接,构建重组表达载体pET-glu,并导入BL21细菌中表达.酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在59 ku左右有融合蛋白带,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6．4,为中性纤维素酶.实验结果为进一步研究内生解淀粉芽孢杆菌TB2纤维素酶的功能和应用打下了基础.     

黄瓜花叶病毒2b基因在大肠杆菌中的表达及其自激活特性检测

2b蛋白是黄瓜花叶病毒与植物寄主相互作用的一种重要多功能蛋白。用PCR方法扩增目的基因2b,经酶切、连接将其克隆至带有λcI基因的pBT载体上,构建与λcI基因融合的表达载体pBT-CMV 2b,转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′报告菌株,用IPTG诱导表达黄瓜花叶病毒2b基因。Western blot分析结果表明,2b-λcI融合蛋白已成功表达,大小约为38 ku,与预期大小一致。pBT-CMV 2b与空质粒pTRG共转化XL1-Blue MRF′报告菌株,同时以pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为对照。结果显示,CMV 2b蛋白未产生自激活作用,从而为利用大肠杆菌双杂交系统筛选与2b蛋白相互作用的蛋白质研究奠定基础。     

利用SSR分子标记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡

为快速、准确地鉴别中粒种与小粒种咖啡,以不同种源的中粒种和小粒种咖啡为试验材料,对514对SSR引物进行中、小粒种咖啡种间特异性引物筛选,最终筛选到1对特异性引物,该引物在小粒种咖啡样本中扩增出90 bp和110 bp双带产物,而在中粒种咖啡样本中只扩增出90 bp或100 bp的单带产物,根据产物条带的数目即可对中粒种和小粒种咖啡进行鉴别。经随机抽取中、小粒种咖啡样本进行种类鉴别准确性验证,验证结果与实际结果一致。     

春石斛离体培养条件优化及其试管开花研究

以春石斛类原球茎体及其试管苗为试验材料,采用L9(34)正交试验设计,比较不同激素浓度和不同浓度天然附加物对春石斛原球茎增殖和壮苗生根的影响,同时进行离体培养条件的优化,并在此基础上进行试管开花研究.结果表明:(1)最适宜春石斛原球茎增值的培养基为KC+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+100 mL/L椰汁;(2)最适宜春石斛试管苗壮苗生根的培养基为1/2MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA+100 g/L马铃薯匀浆物;(3)在4种不同花色的春石斛中,玫瑰红花色的春石斛试管苗花芽诱导率最高,为38.67％;(4)磷含量增加至原来5倍时,春石斛试管苗花芽诱导率最高,为32.14％.     

假臭草和九里香甲醇提取液对橡胶树白粉病菌抑菌活性的测定

为筛选防治橡胶树白粉病安全有效的植物源杀菌剂,采用孢子萌发抑制法测定22种植物甲醇提取液对橡胶树白粉病菌孢子的抑菌活性.结果表明,假臭草和九里香提取液浓度在0.1 g/mL时,对橡胶树白粉病菌孢子的萌发抑制率分别为43.98％和47.62％,极显著优于其它植物和对照.进一步测定假臭草和九里香提取液的EC50和EC75值,以及其盆栽试验的防治效果与橡胶树叶片丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性.结果表明,假臭草和九里香对病原菌孢子的EG50值分别为0.26 g/mL和0.20 g/mL,EC75值分别为1.12 g/mL和0.99 g/mL.假臭草和九里香提取液浓度在EC75值时,防病效果分别为20.00％和18.67％,显著高于对照.假臭草和九里香提取液处理后,橡胶树叶片的MDA含量极显著低于对照,CAT、SOD和PAL活性则显著或极显著高于对照.由此可见,假臭草和九里香提取液不仅能抑制病原菌的萌发和生长,而且能提高橡胶树的抗病性.     

抗啶虫脒椰心叶甲种群对椰甲截脉姬小峰和椰心叶甲啮小蜂抗药性选育的影响

筛选椰心叶甲对啶虫脒的抗药性,并以筛选后的椰心叶甲作为椰甲截脉姬小峰和椰心叶甲啮小蜂的寄主,观察这两种寄生蜂后代种群的抗性水平变化情况.结果表明,经筛选后,椰心叶甲的抗性水平增长了1.33倍,椰甲截脉姬小峰和椰心叶甲啮小蜂的抗性倍数分别增长了2.3倍和2.73倍,且椰心叶甲及其寄生蜂的后代种群抗性个体频率均显著高于初始种群.表明可利用椰心叶甲的抗药性来促进椰甲截脉姬小峰和椰心叶甲啮小蜂的抗性选育.     

人工改造基因Cry1Abm的合成、原核表达及其抗虫鉴定

根据植物密码子的偏好性及使用频率,对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行优化和改造,改造后的Cry1Abm基因序列与原始序列同源性为66.2%,G+C含量由37.3%提高到62.7%。人工合成Cry1Abm基因,并将人工合成的改造后的Cry1Abm基因构建到原核表达载体pET28b中,构建原核表达载体pETAbm。将原核表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,用诱导表达的蛋白进行饲虫（玉米螟）实验。结果表明,该蛋白对幼虫具有很强毒性,幼虫的死亡率高达86.63%,同时,存活幼虫的生长发育也受到明显抑制。该基因可以作为杀虫工程及培育转基因抗虫作物的候选基因。     

施用猪粪对土壤和菜心砷含量的影响

采用盆栽试验的方法,研究施用猪粪对土壤和菜心砷含量的影响。结果表明,随猪粪施用量的增加,土壤全砷、有效态砷和菜心砷含量均提高,且均与猪粪施用量呈极显著的正相关。施用猪粪的同一处理相比较,第2茬土壤全砷、有效态砷和菜心砷含量均高于第1茬。相关分析表明,施用猪粪导致土壤有效态砷含量提高是菜心砷含量增加的主要原因,土壤有效态砷含量可以作为衡量猪粪安全施用的指标。     

新疆小麦品种 Glu A3和 Glu B3位点等位变异的分布

为给新疆小麦品质育种提供理论依据,利用 GluA3、 GluB3位点上的17个STS标记检测了185份新疆冬、春小麦品种 GluA3和 GluB3位点的等位变异。结果表明,新疆小麦品种以 GluA3c、 GluB3a和 GluB3j亚基为主,其分布频率分别为64.86%、22.70%和17.84%。新疆冬、春小麦品种在 GluA3位点上均以 GluA3c亚基为主,分布频率分别为63.30%和67.11%;在 GluB3位点上,新疆冬、春小麦品种分别以 GluB3j和 GluB3a为主,分布频率分别为22.02%和26.32%。新疆冬、春小麦农家品种亚基类型较少,冬小麦农家品种仅有5种类型（以 GluA3c和 GluB3i为主）,春小麦农家品种有10种类型（以 GluA3c和 GluB3d为主）。引进品种和自育品种亚基类型丰富,冬小麦引进品种以 GluA3c和 GluB3i为主,分布频率为12.84%和6.42%;春小麦引进品种以 GluA3c和 GluB3j为主,分布频率为17.11%和6.58%。冬小麦自育品种以 GluA3c和 GluB3j亚基类型为主,分布频率为45.87%和18.35%;春小麦自育品种以 GluA3c和 GluB3a亚基类型为主,分布频率为36.84%和18.42%。     

小麦Mlo基因的克隆及白粉病菌诱导下的表达模式分析

为了研究Mlo基因在感、抗小麦品种中的表达情况,根据小麦基因芯片的Mlo探针序列,利用电子克隆与RT-PCR方法在感病小麦品种豫麦13和抗病品种红蚰麦中分别克隆到Mlo基因的同源序列。两条核苷酸序列全长均为1 605 bp,都含有一个完整的ORF(Open reading frame)。核苷酸序列分析显示二者的DNA序列只有一个核苷酸的差异,与大麦Mlo的相似性均为90%。编码的氨基酸序列包含有7个跨膜结构域,前18个氨基酸是信号肽序列,第414~435位是编码蛋白的活性中心,第451、459、462、475、483位点上有糖基化位点,细胞定位分析将其定位在膜上。从头建模分析构建的二者三维结构有明显差异。利用定量PCR对该基因在白粉菌诱导早期的表达模式进行分析,结果两基因的表达都受白粉菌的诱导,但在红蚰麦中的表达高峰出现在18 h,豫麦13中的表达高峰出现在72 h,表达时间的差异可能决定了两者对白粉菌的不同抗性反应。     

施用猪粪对土壤Cu形态和菜心Cu含量的影响

采用盆栽试验的方法,研究施用猪粪对土壤和菜心铜含量的影响。结果表明,土壤全Cu、有效态Cu和菜心Cu的含量均随猪粪施用量和猪粪施用茬数的增加而提高。施用猪粪明显降低土壤残留态Cu含量,提高土壤交换态、松结有机态、紧结有机态和固体颗粒态Cu含量,其中尤以交换态、松结有机态Cu的增加最为明显。统计分析结果表明,交换态和松结有机态Cu是菜心吸收Cu的主要来源,并与土壤全Cu、有效Cu含量具有极显著的相关。