IPTG诱导浓度对重组人肝再生增强因子基因表达的影响

以人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因与含有T7启动子的融合表达载体pET28a(+)相连的重组子(pET-A)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同IPTG诱导浓度对于表达产物的影响,以确定最佳的IPTG诱导浓度。结果表明,当IPTG终浓度为1.0mmol·L-1时,hALR表达量最大。这为IPTG作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了可靠的实验依据。     

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及可溶性分析

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化。根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带。连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21(DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA。IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性。PCR扩增的hlyA基因全长约1 600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60 kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式。成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白。     

单核增生性李斯特杆菌感染和李氏溶血素

单核增生性李斯特杆菌病能引起绵羊、人和其他很多动物疾病,在免疫学检测上有重要意义,在研究胞内菌感染的分子机制上也是一个重要的模型。但由于当前血清学试验上的非特异性和非敏感性,使李氏杆菌病的诊断和流行病学调查存在困难。在所有致病性的李斯特杆菌中,李斯特溶血素是主要致病因子,现已经有用其做诊断抗原的报道。文章论述了近年来单核增生性李斯特杆菌及李氏溶血素的最新进展,对研究李氏杆菌病的发病机理有一定作用。     

鸡β 防御素Gal 3在大肠杆菌中的诱导表达

利用 IPTG 作为诱导剂进行鸡β 防御素 3 基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。分别对影响重组蛋白表达的因素（IPTG浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和溶氧量）进行优化,最终得到最佳的IPTG诱导条件： IPTG的终浓度为0.6 mmol/L，诱导起始吸光度A₆₀₀为0.6，最适溶氧量为150 mL 三角瓶装50 mL培养基，且在 33 ℃ 下诱导4 h 重组蛋白表达量达到最大。该方法为工程化生产提供良好的试验依据。     

猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区原核表达IPTG最佳诱导条件的确定

将猪流行性腹泻病毒编码M蛋白囊膜外区的基因片段（M’）亚克隆后，构建重组质粒pGEX-6p-M’并转化大肠杆菌以不同浓度IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明，在以浓度为0．3-0．5mmol／L的IPTG诱导6h条件下pGEX-6p-M’获得了最高效表达。     

牦牛SRY蛋白表达条件的优化

将含有天祝白牦牛SRY基因编码区的原核表达载体pET-28a/SRY转入E.coliBL21(DE3)中,在通用条件下诱导表达;同时用Western-blot对表达产物进行检测;在不同温度、诱导时间和IPTG浓度下对表达条件进行优化。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在31℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,SRY蛋白表达量最高。     

产单核细胞李斯特菌溶血素O单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗产单核细胞李斯特菌溶血素O(LLO)的特异性单克隆抗体。【方法】用LLO重折叠的原核表达产物LLO-his免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞,与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,经间接ELISA法筛选、多克隆及单克隆分离出阳性细胞株后,再用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,间接ELISA法测定其效价及相对亲和常数;用HBT单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚型;常规方法制备染色体,观察细胞株染色体数目及标志染色体;Western blot检测抗体的特异性。【结果】获得了2株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为3F5-G3和2B4-C8,其腹水效价分别为1∶(1×105)和1∶(1×107);染色体分别为97±5和93±8条,且观察到标志染色体;相对亲和常数分别为0.49和0.26μg/mL;抗体亚类均为IgG1,轻链均为κ链。特异性鉴定结果表明,2种单克隆抗体均可与LLO蛋白发生特异性反应,而与载体蛋白不发生反应。【结论】获得了抗LLO的特异性单克隆抗体。     

猪肠球菌溶血素cylA基因原核表达载体的构建

以猪致病性粪肠球菌染色体DNA为模板,PCR扩增溶血素cylA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET32a中,构建pET32a-cylA重组质粒,并将pET32a-cylA质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经HindⅢ、XhoI双酶切及测序鉴定,并与已发表的肠球菌溶血素cylA基因序列比较,同源性达99.8%。表明成功构建猪肠球菌溶血素cylA基因的重组表达质粒,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定了基础。     

牛角地黄汤对α-溶血素诱导红细胞溶血的抑制作用研究

[目的]牛角地黄汤是中国传统医学中用于清热解毒凉血化瘀的基础方剂,由水牛角、地黄、赤芍、丹皮、钩藤等主要成分组成。本研究旨在研究分析牛角地黄汤及方剂中主要成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素诱导兔红细胞溶血作用的影响。[方法]将牛角地黄汤水煎剂及其各单味中药的水煎剂分别与金黄色葡萄球菌溶血毒素作用不同时间后检测溶血活性。[结果]研究发现,无论与溶血素同时给药或是在溶血素染毒之前给药,亦或是与溶血素预先单独作用一段时间后再给药,牛角地黄汤煎剂均能抑制α-溶血素致兔红细胞破裂的溶血作用。同时还发现,方剂中的赤芍和丹皮水煎液对溶血素破坏兔红细胞致溶血的活性抑制作用最为明显,是牛角地黄汤中起主要抗溶血作用的中药组分。而牛角和地黄的水煎液在各试验条件下均未表现出抑制溶血素溶血的作用。[结论]本研究表明,牛角地黄汤具有显著的对抗溶血素诱导红细胞溶血的作用,方中起主要作用的成分是赤芍和丹皮,钩藤的这种作用则比较弱,而牛角和地黄则不是牛角地黄汤中抗溶血作用的主要成分。     

片球菌素对酸奶中单核细胞增多症李氏杆菌的抑菌作用

将从泡菜中分离出的一株产片球菌素的乳酸片球菌接种至MRS培养基,培养后采用基于pH的吸附和解吸附法提取片球菌素,以单核细胞增多症李氏杆菌CVCC1595(4.55×108cfu/mL)为指示菌,采用琼脂扩散法,测定片球菌素的抑菌活性.结果表明,其对单核细胞增多症李氏杆菌CVCC1595的最小抑菌浓度为1.6 g/mL,随机活性单位为21.875 AU/mg.将片球菌素(0.01 mg/mL)添加到人工污染单核细胞增多症李氏杆菌CVCC1595的酸奶(6.305 log cfu/mL)中,1 d以后其菌落数下降为4.301 log cfu/mL,并可以在30 d的实验周期内保持抑菌作用.     

乳糖诱导重组人TRAIL胞外片段在大肠杆菌中的表达

以重组人TRAIL胞外片段蛋白表达宿主菌株BL21(DE3)(pET3(c)/hTRAIL)作为研究对象,借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导由T7 lac启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了优化研究。分析比较菌株诱导起始生长量、乳糖诱导浓度、乳糖诱导时间等因素对重组产物表达的影响。结果表明,乳糖能够很好地诱导重组目的产物的表达。在优化诱导表达条件之后,乳糖诱导的目的产物的表达量与IPTG的诱导量相当,并且具有较好的可溶性及抗肿瘤活性。     

内含肽融合标签介导的人乙醛脱氢酶2基因原核表达

为获得高活性重组人乙醛脱氢酶2(ALDH2)重组蛋白,研究通过PCR获得ALDH2基因,先后构建克隆和表达载体p GEM-ALDH2和p TYB11-ALDH2。转化的阳性重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示融合蛋白获得大量表达。通过正交试验对表达条件优化设计,结果表明,诱导OD值0.3,30℃,IPTG浓度1.0 mmol·L-1,诱导表达4 h为最优表达条件。由于融合蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性,使用IMPACTTM-CN蛋白纯化系统,经内含肽标签蛋白自裂解洗脱、纯化,获得仅含有几个载体氨基酸的ALDH2蛋白,蛋白浓度为0.045 mg·m L-1。纯化的ALDH2蛋白比活力为462 U·mg-1。     

hGDF-15基因的克隆及原核表达

【目的】克隆人生长分化因子-15(Human growth differentiation factor-15,hGDF-15)成熟肽基因,构建其原核表达载体,并进行诱导表达,为hGDF-15药理活性和生物学功能研究奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆人hGDF-15成熟肽基因,将其连接到pET-28a载体上构建pET-28a-hGDF-15原核表达载体,并将此载体转入Rosetta(DE3)大肠杆菌感受态细胞,获得重组大肠杆菌,对目的蛋白分别采用不同温度(16,25,37℃)、IPTG浓度(0.10,0.25,0.50,0.75,1.00mmol/L)和时间(12,24,36,48h)进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测,利用Gel Quant Express软件对菌体破碎离心的上清组分和沉淀组分中的蛋白含量进行测定,通过正交试验,分析上清组分和沉淀组分的最适诱导表达条件。【结果】成功获得hGDF-15成熟肽基因,其长度为339bp;构建了pET-28a-hGDF-15原核表达载体,并诱导表达了hGDF-15蛋白;优化的上清组分最适诱导条件为IPTG浓度0.25mmol/L、温度16℃、时间24h,沉淀组分最适诱导条件为温度37℃、时间36h、IPTG浓度1.00mmol/L。【结论】成功克隆了hGDF-15基因,在大肠杆菌中诱导表达出其编码蛋白,并优化出了最适诱导表达条件。     

Prokaryotic Expression of Listeriolysin O (LLO) Gene in Escherichia coil and Analysis of Soluble LLO Protein

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化.根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带.连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21 (DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA.IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性.PCR扩增的hlyA基因全长约1600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS- PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式.成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白.     

重组单增李斯特菌溶血素O在HEK293T细胞中的分泌表达及活性分析

为研究单增李斯特菌分泌的溶血素O(LLO)的免疫佐剂作用,需要构建其真核表达载体,使其在动物体内进行分泌表达,从而发挥其生物佐剂活性。为此,本试验通过PCR方法从LM基因组DNA中扩增了LLO基因,并将其插入到带有CD5信号肽的质粒pcDNA3.1ACD5sp的信号肽下游构建成真核表达载体,然后转染人胚肾细胞HEK293T细胞使其分泌表达,用Ni-NTA琼脂糖凝胶层析法从培养基中分离纯化重组LLO蛋白,通过Western-blot对其进行鉴定,并用溶血试验鉴定其生物活性。结果表明,扩增的LLO基因序列与GenBank中的基因序列完全一致,在HEK293T细胞中表达的重组LLO在CD5信号肽介导下能被分泌到细胞外,并具有较强的溶血活性,这为进一步研究LLO的功能提供了必要的条件。     

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒 VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a( )中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.     

高糖培养对乳鼠海马神经元存活及c-fos蛋白表达影响

目的探讨高糖培养对乳鼠海马神经元存活及c-fos蛋白表达影响。方法无血清体外培养方法获得新生SD乳鼠海马神经元,分为正常组和高糖6、12、18、24h共5组。分别用PI/Hoechest33342染色法、免疫荧光细胞化学法检测检测海马神经元存活率及c-fos蛋白表达。结果高糖24h组海马神经元存活率明显低于正常组及高糖6、12、18h组(P<0.01)。高糖处理后,c-fos蛋白表达在6h开始出现,12h达高峰,此后逐渐下降(P<0.01)。结论高糖培养导致的乳鼠海马神经元存活率下降与c-fos蛋白表达有关。