A 蛋白酶联法检测植物病毒的研究

用一种动物的特异抗体,与市售 A 蛋白(SPA)、A 蛋白酶标记物(HRP-SPA)组合成 A 蛋白酶联免疫吸附试验(SPA-ELISA)检测南方菜豆花叶病毒(SBMV)、烟草花叶病毒(TMV)纯化抗原和病株粗澄清液,灵敏度分别为0.128μg/ml 和1:10000。使用的 A 蛋白包被的适宜工作浓度为2.5μg/ml,兔抗 SBMV 血清作第一抗体适宜工作浓度为1:100000,作第二抗体适宜工作浓度为1:1000。检测 TMV 也得到相似的结果。该法的灵敏度是 ELISA-异种动物抗体双夹心法的1～25倍;是 ELISA 间接法的10～125倍;是免疫双扩散法的3000～6000倍。应用这种酶联法既不需要纯化抗体、也不要自己制备酶标记抗体,又不需要制备第二种动物特异抗体就可以得到酶联双抗体夹心法和异种动物抗体双夹心法相似或更好的结果,使 ELISA 更适于在植物检疫上推广应用。     

检测植物病毒ELISA异种动物抗体双夹心法的研究和应用

 制备南方菜豆叶花叶病毒、大豆花叶病毒、烟草花叶病毒、番茄不孕病毒、苜蓿花叶病毒的兔抗血清和鼠腹水抗体,组合成ELISA异种动物抗体双夹心试验。抗体球蛋白的适宜工作浓度为4微克/毫升;未经纯化的特异抗血清(抗体)的适宜工作浓度为10^-4(即1/10,000)稀释度。检测以上5种病毒的灵敏度:提纯抗原为10-0.64毫微克/毫升;病叶澄清液为1/10,000-1/100,000稀释度。本法灵敏度与ELISA双抗体夹心法相当或略高。一般8小时内可得出结果。适用于大量样品的检测。     

酶联免疫技术检测玉米弯孢菌叶斑病的研究

本文通过提取玉米弯孢菌叶斑病病原菌蛋白质，免疫家兔制备抗血清，用不等弯孢菌、玉米小斑病菌，玉米圆斑病菌和玉米大斑病菌（与弯孢菌相似或相近）蛋白吸附除去抗血清中的交叉反应抗体，提高了抗体的特异性，建立了酶联免疫检测玉米弯孢菌叶斑病的技术，应用ABC-ELISA和间接ELISA检测玉米弯孢菌叶斑病，比较了两种方法的灵敏性和特异性。结果显示ABC-ELISA较间接ELISA检测灵敏度高2到5倍。     

用酶联免疫吸附技术（ELISA）检测水稻细菌性条斑病菌的研究

兔抗 Xanthomonas campestris pv.oryzicola 抗血清经提纯得特异性免疫球蛋白 IgG,用过典酸钠法标记获辣根过氧化物酶标兔抗 X.c.pv.oryzicola IgG 结合物。ELISA 双抗体夹心法和间接法的灵敏度分别为10~2～10~3个菌/ml 和10~4～10~5个菌/ml,这两种方法检测稻谷带菌的结果与用七叶苷选择性培养基分离及琼脂双扩散验证结果一致,双抗体夹心法的灵敏度和特异性比间接法高,从制样到完成检测约需40小时。检测结果不但可以目测定性,还可用酶联免疫检测仪所测得的 OD 值在本试验制作的曲线上查出稻谷带菌量。     

“单克隆抗体”及其在植物病理学中的应用

植物病害的诊断和病原物的鉴定常采用血清学方法,尤其是酶联免疫吸附技术具有特异性强、灵敏度高、简便易行等优点,更被广泛应用。但在制备抗血清过程中需要高纯度的抗原,且每只动物所产生的抗血清数量有限,难以获得对病原物种以下株系、菌系或亚型特异性的抗体,以致在科研和生产应用上受到一定限制。     

酶联免疫吸附试验在捕食作用研究中的方法与应用

在评价捕食作用的诸多实验方法中，以高灵敏度和特异性强的酶联免疫吸附试验最有应用前景。它主要包括抗原的提取、抗血清的制备、捕食者的采集与保存、酶联抗体的制备和检测等步骤。其中高效价、特异性强的抗血清的制备是成功的关键。文中也分析了该方法的优缺点和有待进一步研究的问题，并结合实际阐述了试验所得的阳性反应率在定量评价捕食作用上的具体应用。     

除草剂酶联免疫吸附测定研究进展

酶联免疫分析技术具有方便快速、特异性强、灵敏度高等优点,近年来广泛应用于农药残留检测.本文介绍了酶联免疫分析技术在除草剂残留检测中的应用研究进展,分别介绍了各类除草剂的半抗原合成方法以及抗体的灵敏度,探讨了酶联免疫吸附分析法存在的问题和应用前景.     

酶联放大系统提高常规酶联检测灵敏度的研究

以莴苣花叶病毒（Ｌｅｔｕｃｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）及其单克隆和多克隆抗体为试材，以直接ＥＬＩＳＡ、生物素抗生物素ＥＬＩＳＡ和异种动物双抗体夹心ＥＬＩＳＡ为方法，分别用酶联放大系统进行比较，发现酶联放大系统比常规的方法灵敏度高３～１０倍，其中以生物素抗生物素酶联放大系统效果最好，灵敏度达１ｎｇ     

抗体制备方法的研究进展

由于抗体的反应特异性 ,抗体的应用广泛 ,不仅是细菌、病毒、外源蛋白等的诊断和检测试剂 ,而且还是人和动物某些疾病的诊断试剂和有效治疗药物。抗体制备方法经历了常规血清技术、杂交瘤技术、基因工程抗体技术及抗体库技术 ,本文将分别阐述。1　常规血清技术常规的抗体制备包括抗原的制备、免疫动物、抗血清制备及特异抗体纯化等步骤。获得的抗体是针对多个不同抗原决定簇的抗体混合物 ,因此称之为多克隆抗体 ,简称多抗。制备抗体 ,关键是获得高产量、高纯度的抗原。抗原的获得方法有以下几种。1 1　抗原提取剂若抗原易获得 ,或易提纯 ,…     

酶联免疫吸附试验检测水稻条纹叶枯病介体昆虫带毒率

应用酶联免疫吸附试验的双抗体夹心法检测水稻条纹叶枯病毒,灵敏度可达125ng/ml,重复性和特异性均较满意,操作简便,试剂稳定,适用于常规检测。试验用辣根过氧化物酶与提纯的抗 RSV 抗体球蛋白交联,制得酶标抗体,以磷苯二胺为底物,最适包被抗体浓度为0.5～1μg/ml,最适酶标记抗体浓度为0.15μg/ml,能检出抗原的最低浓度;病叶澄清液稀释度为1:6400。应用酶联免疫吸附试验检测水稻条纹叶枯病介体昆虫带毒率,以生物接种测定法为对照,检测1936头灰稻虱,符合率为97.9%,在农业生产上具有实用价值。     

苏云金杆菌HBF-1菌株在土壤中毒蛋白含量的ELISA检测

以苏云金芽孢杆菌HBF-1菌株中分离纯化的高特异性杀虫蛋白作为抗原，免疫新西兰白兔制备出多克隆抗体，其效价可达到16000。应用制备的特异性抗体建立了间接酶联免疫吸附测定法（ELISA），检测不同土壤样品中Bt毒蛋白含量。初步结果表明，该方法能够检测土壤中Bt毒蛋白的含量，因土壤理化特性及组成成分的不同，检测到的毒蛋白含量也略有不同，河沙中的蛋白检测量最低，只有12．53％；另一种沙壤混合物中检测量达到76.16％。     

南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏度进行评价。结果显示,建立的RT-RPA方法特异性强;灵敏度达到0.1 ng。本研究建立的RT-RPA方法检测SBMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。     

单抗I-ELISA和TAS-ELISA检测百合无症病毒的研究

 以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接ELISA (I-ELISA)和三抗体夹心ELISA (TAS-ELISA)的检测方法。I-ELISA检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1:20和1:6 000,对病叶汁液的检测灵敏度达到了1:2 560,可检测到提纯病毒绝对量为1.35 ng。TAS-ELISA检测体系中捕获抗体和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1:200和1:6 000,检测病叶汁液的灵敏度达到了1:5 120,对于提纯病毒可检测到0.68 ng。使用美国Agdia公司双抗体夹心ELISA (DAS-ELISA)检测试剂盒对病叶汁液的检测灵敏度为1:2 560,提纯病毒检出量1.35 ng。用3种ELISA方法检测了采自浙江省丽水市的46个田间样品,I-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA测出的阳性样品数分别为19、21和18个,阳性率为41%、46%和39%。灵敏度检测和田间样品检测结果显示,TAS-ELISA的灵敏度高于DAS-ELISA和I-ELISA。相同样品I-ELISA所测出的OD₄₀₅值和P/N值普遍高于DAS-ELISA,表明LSV单抗比多抗具有更强的特异性和更高的灵敏度。     

番茄褐色皱果病毒胶体金免疫试纸条的研制

 番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)是一种新发病毒,严重威胁番茄的安全生产。为了快速、简便地检测该病毒,我们制备了ToBRFV胶体金免疫试纸条。本研究以ToBRFV粒子为免疫原,通过杂交瘤技术制备了17个抗ToBRFV的单克隆抗体。将不同单抗两两组合分别作为胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜检测线上的捕获抗体,共获得272个配对组合的胶体金试纸条。通过特异性测定筛选到一组配对抗体制备的试纸条能够在5 min内特异识别ToBRFV,而与番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、番茄褪绿病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等无交叉反应。灵敏度分析表明,该试纸条可从稀释12 800倍的番茄叶片病汁液中检测到ToBRFV,也可检测到50 ng ToBRFV粒子。本研究制备的胶体金试纸条使用方便,灵敏度高,特异性强,适合田间大批量样品检测,可用于ToBRFV的精准监测及早期预警。     

ELISA检测植物病毒过程中减少非特异反应的有效方法—酶联板处理

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种快速、准确、经济、简便的免疫学检测手段,并具有作大规模检测和灵敏度高的优点。但用于植物病毒粗汁液检测,往往存在着病健样品的吸收值之比(P/N)太低,阴阳性反应难以判别的问题。酶联板的处理能消除或大大减缓此问題。在本实验中,我们用氢氧化钠/乙醇液处理酶联板,效果十分显著。在对不同组10种植物病毒粗汁液的检测中,使用处理板并设未处理板作对照,结果前者无一例外的大大提高了病毒特异性吸收值及P/N值,从而使ELISA检测植物病毒粗汁液的特异性吸收值提高0.8～5倍,灵敏度提高10～1000倍。     

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein, CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。     

拟除虫菊酯类农药酶免疫分析方法研究进展

对拟除虫菊酯类单一农药残留和多残留酶免疫分析方法的研究进展进行了综述。在介绍单一农药残留酶免疫分析方法中半抗原分子设计和ELISA方法建立的基础上,指出刚性连接臂是菊酯类农药免疫半抗原分子设计的一般原则,包被原和免疫原采用不同的载体蛋白和不同结构的半抗原有利于菊酯类农药ELISA方法的建立。在介绍菊酯类农药多残留酶免疫分析方法时,剖析了通用免疫半抗原的结构特点,阐述了宽谱特异性抗体的筛选方法,揭示了在菊酯类农药多残留酶免疫分析法中存在竞争半抗原的选择具有盲目性、宽谱特异性抗体对不同农药的特异性差异较大的问题。并对拟除虫菊酯类农药通用免疫半抗原设计及多残留酶免疫分析技术的发展趋势进行了探讨。     

免疫检测技术在农药残留分析中的应用

免疫检测法(Immunoassay)是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。免疫是机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。免疫反应,即抗体抗原反应,不仅发生在生物体内,在体外亦能进行,而且反应是高度特异性的,遵循质量作用定律。现代测试仪器快速灵敏,对于一些物质如荧光素、放射性同位素、酶等,在极微量时都可检出。因此上述两个方面的结合,建立了一系列的免疫检测方法,如用荧光素标记抗原或抗体的荧光免疫法(FIA),用放射性同位素标记抗原的放射免疫法(RIA),用酶标记抗原或抗体的酶免疫法(EIA)等。这些方法选择性强,灵敏度高,简单快速,迅速发展成为现代生物化学、医学、临床化学和药物化学等研究领域的重要工具。     

番茄斑萎病毒4种检测方法比较

本研究根据番茄斑萎病毒(TSWV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因保守序列设计特异性引物,比较了4种检测方法的灵敏度。结果表明,特异性引物可扩增出397bp的片段,序列和已发表的TSWV核苷酸序列同源性高达99%,可用于常规PCR和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测。qRT-PCR的灵敏度比快速检测试纸条、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和常规PCR分别高出15 625倍、3 125倍和125倍,且能够准确定量;常规PCR灵敏度较高,但不能准确定量;DAS-ELISA方法适用于批量定性测定,但检测时间较长;试纸条法检测速度最快,但灵敏度最低,使用时可根据症状程度和试验条件选择适宜的检测方法。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测

 为检测几丁质酶的表达,制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体,探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后,用Ni²⁺\|NTA亲和柱纯化蛋白,得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800,特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中,不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证,结果表明,稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关,目前正在进一步研究。