实时荧光定量PCR检测PrP基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

对金黄地鼠P rP基因序列进行分析,选择其高度保守区域设计引物,对金黄地鼠各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明P rP基因保守区段已经成功克隆。将107~102拷贝/反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,10次重复C t值平均分别为17.50±0.5、21.38±0.2、25.29±0.7、29.12±0.7、31.34±0.4、33.89±0.1,系统自动分析软件显示C t值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.998。对动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,该标准曲线的灵敏度为102拷贝/反应。荧光PCR P rP基因表达检测标准品质粒和标准曲线的建立,为检测P rP基因的组织特异性表达和动物传染性海绵状脑病发生的分子机理奠定了基础。     

实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.     

实时荧光定量PCR构建BIM基因表达标准品质粒和标准曲线

为了能够快速、准确定量BIM基因的mRNA,试验构建了小鼠BIM基因的标准品质粒和标准曲线,根据Gen Bank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物,从N2a细胞中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增该基因122 bp的核苷酸片段,经纯化、连接和转化后,提取质粒并进行酶切、测序鉴定,然后将阳性重组质粒10倍递减稀释作为标准模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,建立了BIM标准曲线及直线回归方程。结果表明:产物熔解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.998,线性关系好。说明成功构建了目的基因BIM的标准品质粒和标准曲线。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%（107拷贝/反应除外）,说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按10³～10⁷拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r²=0.998、r²=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(10⁷拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

实时荧光定量PCR构建朊病相关蛋白P38MAPK标准品质粒和标准曲线

为进一步揭示朊病的治病机理,根据GenBank中的小鼠p38MAPK的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从N2a细胞中扩增和克隆了该蛋白的309 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了p38MAPK标准曲线及其直线回归方程。所构建的标准曲线的相关系数r2=0.999,说明成功构建小鼠N2a细胞p38MAPK基因的标准质粒和标准曲线,为研究朊病的发病机理奠定了分子生物学基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。     

荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal,adrenal hypoplasia critical region,on chromosome X,gene 1,DAX1)设计引物,构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒,作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品,建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法.结果表明,该方法特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～106拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%),可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法.     

实时荧光定量PCR检测鸡生长激素基因方法的建立

本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。     

实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV

根据GenBank发表的PRRSV、CSFV基因核苷酸序列,应用Primer 5.0软件分别设计了2对特异性引物.以重组质粒作为阳性标准品,应用SYBR Green I real-time PCR检测两种病毒的核酸含量.在样品稀释到10.1～10<'-11>拷贝时,能得出良好的线性关系,相关系数为R<'2>=0.999...     

荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转－先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1,DAX1)设计引物,构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒,作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品,建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～106拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%),可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法。     

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

Real—time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒

为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法.通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高.通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率.