重组伪狂犬病病毒SA215(C)株的构建及其对小鼠的免疫原性

为了研制猪2型圆环病毒（PCV2）基因工程疫苗,以伪狂犬病病毒（PRV）基因缺失疫苗株SA215为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因重组伪狂犬病病毒SA215（C）株。经PCR、Southern blotting、Western blotting等证实SA215（C）构建正确,并能表达具有活性的ORF2基因蛋白和荧光蛋白。SA215（C）在IBRS-2、ST细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响病毒增殖。用SA215（C）免疫BALB/c小鼠10周后检测免疫小鼠PCV2抗体和PRV中和抗体及细胞免疫反应。结果显示,SA215（C）诱导小鼠产生了PCV2和PRV抗体并出现PCV2的细胞免疫反应。另外,以105TCID50的SA215（C）株接种BALB/c小鼠,接种后28d再接种1次,2次接种后2周,用107TCID50PRVFa和PCV2强毒联合进行攻击,结果免疫小鼠抵抗住强毒的攻击,获得了保护;表明该毒株具有很强的免疫原性,为研制安全、有效的PCV2-PRV二价基因工程疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)生物学特性研究

测定了伪狂犬病gE^-／gI^-／TK^-／LacZ^ 基因缺失疫苗株(SA215)的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性。试验结果显示，该疫苗株能在Vero细胞上适应生长，并形成典型的蚀斑。其对1日龄仔猪、妊娠母猪、牛、羊以及家兔安全，无不良接种反应，接种动物不向外散毒。SA215疫苗接种猪能抵御高剂量(10’PFU)Fa株强毒感染，攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度略低于Bartha株疫苗接种猪，低于对照组猪。SA215接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度。试验结果表明，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了2个利用人类巨细胞病毒（HCMV）的启动子启动表达伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的真核表达质粒pCIDI和pcDDI，体外转染BHK－21细胞，用间接免疫荧光法检测，证实糖蛋白gD在细胞中得到表达。用表达质粒pCIDI和pcDDI作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体，结果其滴度为1：128－1：1512。初步证实，用gD基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答反应。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)株的构建及生物学特性研究

采用磷酸钙转染系统，将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA215株DNA与PP63LacZE2 DNA共转染Vero细胞，获得SA215（A）1、SA215（A）2和SA215（A）3等12个重组病毒株。以光生物素标记的HCV E2基因为探针进行初步鉴定后，挑选SA215（A）1株作BamHI酶切和southern转印杂交鉴定，结果表明构建是成功的，将其命名为SA215（A）。直接荧光抗体检测、SDS-PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCV E2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约51 ku的囊膜糖蛋白。对SA215（A）株进行部分生物学特性研究，培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK21和鸡胚成纤维细胞等多种细胞，但对不同细胞系表现有一定的差异。SA215（A）株10^5 PFU／mL接种21日龄健康仔猪（伪狂犬病和猪瘟检测阴性），接种后28d用10^6 PFU的PRV Fa强毒株滴鼻攻毒，42d用猪瘟SM株血毒1mL（10^5 MLD／mL）肌肉注射攻击，结果表明接种猪能抵御2次病毒攻击，表明SA215（A）株具有良好免疫原性，是一株优秀的猪瘟、伪狂犬病二价疫苗候选株。     

表达日本乙型脑炎病毒E蛋白重组伪狂犬病病毒SA215（E）的构建

将日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)CQRC-1株的E基因通过RT-PCR产生,克隆到pMD18-T simple载体中,再亚克隆到转移载体pPI-2,EGFP中,命名为PPE.PPE质粒和伪狂犬病毒(PRV)SA215株DNA通过磷酸钙共转染方法转染到Vero细胞上.通过有限稀释法、噬斑纯化、PCR检测、Southern杂交、West杂交,获得了表达JEV E蛋白的重组伪狂犬病病毒,命名为SA215(E).结果表明,SA215(E)在生长曲线、噬斑形态及大小、在Vero细胞上的病变与PRV SA215一致.安全性试验表明,SA215(E)对小鼠和兔具有较高的安全性,SA215(E)具有很强的免疫原性.接种兔能预防致死剂量的PRV Fa肌肉内攻毒;接种小鼠能预防致死剂量的JEV cQRC-1株腹膜内攻毒.表明该重组病毒是养猪业控制伪狂犬病和乙脑最适合的候选疫苗株之一.     

猪伪狂犬病病毒LY株gD基因的克隆与核酸疫苗研究

将伪狂犬病病毒LY株的免疫糖蛋白基因（gD基因）分别克隆到核酸疫苗载体pIRESneo、pEGFP-C1的多克隆位点上,成功地构建了含有相应目的基因的重组质粒pIgD、pFgD和PRRSVLX-1株的E基因的双基因共表达二联核酸疫苗质粒pID-E。将构建的各核酸疫苗质粒,通过脂质体法分别转染到BHK-21细胞中,经ELISA检测所有目的蛋白均得到表达,表达产物也均具有一定的反应原性。小鼠免疫试验证实这些核酸疫苗质粒具有很好的免疫原性,能诱导小鼠产生特异性抗体,第3次免疫后,抗体阳性率为100%,pIgD抗体效价均不低于1∶160,最高可达1∶640。pIE与pIgD的联合应用时,不影响各自特异性抗体的产生。构建的含有PRRSVE基因和PRVgD基因的双基因共表达质粒pID-E,脂质体转染BHK-21细胞后,经ELISA检测,相应的PRRSV和PRV的目的蛋白均获得了瞬时表达;小鼠免疫试验表明E和gD2种糖蛋白基因能在小鼠体内共表达,且能诱导免疫小鼠产生针对PRRSV和PRV的相应中和抗体。上述研究为进一步探讨PRRSVE蛋白及PRVgD蛋白的免疫生物学特性,进而为开展PRRSV与PRV相关基因在哺乳动物细胞中的联合表达及基因免疫提供理论基础。     

伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒（PRV）Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段，将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明，糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp，与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol／L IPTG诱导后，重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达，其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示，大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。     

伪狂犬病病毒3基因缺失株(SA215)的遗传稳定性研究

测定了伪狂犬病病毒Fa株3基因缺失株(SA215)在鸡胚成纤维细胞上连续传代15代次,在非免疫仔猪体内连续传代5代次后,病毒毒价及对易感动物的安全性变化。并以核酸杂交、核酸酶切和gE-ELISA检测技术分别研究了缺失株(SA215)传代后不同代次病毒的外源插入基因(LacZ)、缺失基因(TK、gE、gI)遗传变异情况。结果表明缺失株(SA215)毒价及对易感动物安全性未发生变化,外源插入基因得到稳定遗传,缺失基因未见回复突变,证明缺失株(SA215)具有良好遗传稳定性。     

我国首株动物基因工程疫苗问世

我国首株动物基因工程疫苗在四川农业大学问世,开创了国内动物病毒基因工程疫苗实用化的先河。四川农业大学教授郭万柱等专家经过10多年的潜心研究,在国内率先开展了伪狂犬病病毒生物学及分子生物学特性的研究,运用缺失、重组和克隆等基因操作技术,成功构建出系列伪狂犬病基因缺失疫苗株。近日,该项成果之一的″猪伪狂犬病基因缺失活疫苗SA215株″获得国家新兽药证书,从而成为我国第一株动物病毒基因工程疫苗。该疫苗较常规疫苗及同类疫苗具有遗传性稳定、安全性好、免疫原性强、抗潜伏感染能力独特等优点,达到国际同类疫苗的应用标准。我…     

抗冻基因及其在基因工程中的应用研究进展

低温是限制植物分布与生长的重要因素,低温伤害是一种严重的自然灾害,全球每年因此造成农作物的损失高达数千亿美元。本文综述了抗寒基因研究中一些已分离和鉴定出的低温诱导表达基因,对抗冻基因的功能特性和作用机制进行了全面的回顾,总结了抗冻基因工程的研究方向,对典型抗冻基因的表达效果进行了比较分析,并提出此领域尚存在的一些问题及发展前景。     

木聚糖酶基因的分子生物学与基因工程

广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称 ,主要包括三类 :( 1 )内切 - β -1 ,4-木聚糖酶 ( 1 ,4- β -Ｄ -木聚糖木聚糖水解酶 ,ＥＣ 3,2 ,1 ,8) ,优先在不同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖 ,从 β - 1 ,4-木聚糖主链的内部切割木糖苷链 ,从而使木聚糖降解为木寡糖 ,其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖 ,也有少量的木糖和阿拉伯糖。 ( 2 )外切 - β -ｌ,4-木聚糖酶 ( 1 ,4- β -Ｄ -木聚糖木聚糖水解酶 ,ＥＣ 3,2 ,1 ,92 ) ,作用于木聚糖和木寡糖的非还原端 ,产物为木糖。 ( 3) β -木糖苷酶 ( 1 ,4- β -Ｄ …     

猪产仔数性状主效基因及其候选基因的研究进展

产仔数性状属于低遗传力数量性状,通过常规选育所获得的进展甚微,许多学者在寻找控制该性状的基因和遗传标记方面做了大量研究,并取得了显著成效。本文综述了猪产仔性状主效基因和候选基因的研究情况及其展望。     

肠炎沙门菌sef14基因缺失株生物学功能

构建了肠炎沙门菌参考株SE50336的SefA主要亚单位编码基因sefA的缺失株SE50336ΔsefA,进一步探究野生株及SEF14菌毛缺失株的生物学功能。以SE50336为模板,利用λ-red同源重组技术构建sefA缺失株,通过绘制生长曲线、生物被膜测定试验、刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基菌落表型试验、RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)、人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)的体外黏附测定来检测和比较2种菌株的生物学特性,并利用野生株和缺失株分别攻毒小鼠,探究SEF14菌毛对肠炎沙门菌致病力的影响。结果显示,野生株及缺失株生长情况无明显差异。与野生株相比,ΔsefA缺失株的生物被膜形成能力有所下降;菌落表型试验中野生株表现出典型的rdar(red, dry and rough)表型,而ΔsefA缺失株表现出saw(smooth and white)表型;RT-qPCR试验中,野生株的生物被膜形成主要关联基因csgA、bcsA、pgaC、fimA的转录量均显著高于ΔsefA缺失株。但缺失株与野生株对于Caco-...     

Canine CD20 gene

The human CD20 antigen, a 35kDa cell surface nonglycosylated hydrophobic phoshpoprotein is expressed consistently on almost all human B-cells, and its monoclonal antibody is used for the therapy on human B-cell lymphoma. In the present study, canine CD20 gene was cloned and sequenced, and the expression of CD20 mRNA was investigated in canine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and lymph nodes from healthy dogs, and canine lymphoma cells. Using canine cDNA as a template, full-length of canine CD20 gene was sequenced by 5'-RACE and 3'-RACE methods. The full-length of the cDNA sequence of canine CD20 was 1239bp encoding 297 amino acids. The amino acid sequences of canine CD20 showed 73 and 68% sequence similarities with those of human and mouse, respectively. Canine CD20 was predicted to contain domains of amino acid sequences consisting of two extracellular domains (EM), four transmembrane domains (TM), and three intracellular domains (IC) as in human CD20. Canine CD20 mRNA was detected in PBMCs and lymph node from healthy dogs, and B-cells of canine lymphoma, but not in T-cell lymphoma cells and non-T and non-B-cell lymphoma cells by RT-PCR analysis. From these results, canine CD20 might be targeted for monoclonal antibody therapy against B-cell lymphoma of dogs.     

锌与基因表达

锌是动植物体组成的必需成分,也是动植物体生长发育过程中必需的微量元素。在动物的生长发育过程中,锌参与不同的细胞进程,包括催化作用、基因表达和细胞凋亡和氧化应激的抑制剂犤1犦。例如,锌至少是60～80种酶的组成部分犤2犦,它在酶中主要是提供结构或催化作用。碳酸酐酶的活     

肌肉生成抑制素基因的研究

动物肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)是Mcpherron等研究小鼠转化生长因子-β(TGF-β)超家族时发现的一种新的生长因子。当时命名为生长分化因子-β(GDF-β),后经研究发现,其对骨骼肌的生长具有负调控作用,因此改名为肌肉生成抑制素[1-3]。该基因编码的蛋白质对骨骼肌有负调控作用,动物缺乏MSTN时出现肌肉增大,骨骼肌肌群分布广,而且不增生脂肪等现象。MSTN主要在胚胎期的骨骼肌中表达,它的缺失使一些动物表现双肌性状[4-7]。1MSTN基因的发现及组织分布Mcpherron等(1997)根据TGF-β超家族的保守区设计一对简并引物,通过PCR扩增…     

鹅细小病毒VP3基因与鹅γ干扰素基因在重组禽痘病毒中的共表达

为了构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因与鹅IFNγ基因的重组禽痘病毒,本研究将GPV-VP3基因和鹅IFNγ基因克隆到禽痘病毒转移载体中,构建串联基因的禽痘病毒转移载体pSY-GoIFNγ-VP3,采用脂质体法将其转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑法筛选重组病毒,并进行8轮蚀斑纯化,以及PCR鉴定和间接免疫荧光(IFA)分析。结果表明,所获得的重组病毒rFPV-GoIFNγ-VP3能稳定表达外源基因。本研究为进一步开展GPV重组禽痘病毒疫苗的研制奠定了基础。     

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析,为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增,将其克隆到p MD-18T并与p Chlamy-4载体相连,重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白,结果可得:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原,鼠抗IHNV血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗,再次进行Westen Blot检验,其结果显示,经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应,并在58 k Da处出现了一条明显的特异性条带,具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。     

轮状病毒VP7基因与LTB基因融合表达及其免疫原性

根据GenBank已发表的牛轮状病毒VP7基因核苷酸序列(DQ195152),成功克隆了牛轮状病毒野毒株CHLY VP7基因的3个主要抗原簇并在大肠杆菌中进行了高效表达,然后与LTB(大肠杆菌不耐热性肠毒素)基因融合后再一次成功表达,表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,得到了高纯度的目的蛋白。动物试验表明,该抗原蛋白可在小鼠体内诱导产生一定水平的抗体。