减毒沙门氏菌为载体的草鱼口服生长抑素DNA疫苗的构建及其稳定性

将生长抑素(SS)和乙肝表面抗原基因(HBsAg)融合后，插入真核表达载体pcDNA3，构建成pcDNA3-SS，再转化减毒沙门氏菌(S．typhimurium,dam^-和phop^-)，构建了以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素口服DNA疫苗ZJ111／pcDNA3-SS，并通过体外传代、灌服草鱼检验了ZJ111／pcDNA3-SS的侵袭力及体外和侵入草鱼体内过程中的德定性。对草鱼肝脏和脾脏分离菌的生化特性检验和特异性PCR鉴定表明，ZJ111／pcDNA3-SS能很好地侵入草鱼体内；对在Amp^ 、Amp^-平板上传5、10代和灌服7d后草鱼肝、脾脏分离的减毒菌抽提重组质粒进行PCR和酶切鉴定表明．减毒菌中的重组质粒在体外和侵入草鱼体内过程中具有较好的稳定性。     

减毒沙门氏菌为载体的口服生长抑素DNA疫苗对草鱼的安全性

幼草鱼灌服10^8、10^9、10^10cfu／mL减毒沙门氏菌为载体的口服生长抑素DNA疫苗ZJ111／pcDNA3-SS，另设野生型鼠伤寒沙门氏菌（10^9cfu／mL）和PBS对照组，试验期20d，观察并比较各组死亡率。另取150g左右的草鱼灌服PBS、10^8cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS和10^8cfu／mL野生型鼠伤寒沙门氏菌组，7d后屠宰取肝和脾脏，做透射电镜切片观察。结果显示，灌服10^9cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS的幼鱼在试验期间死亡2尾，灌服10^8cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS和PBS的幼鱼采食和生长正常，灌服野生型S．typhimurium和10^10cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS的幼鱼死亡率分别为76．67％、26．67％。灌服10^8cfu／mL ZJ111／pcDNA3-SS的草鱼肝、脾细胞形态正常，肝脏线粒体略微肿胀，内质网间距略有增大，但病变特征不明显；10^8cfu／mL的zJ111／pcDNA3-SS对草鱼具有相对安全性。     

减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

将携带鸡柔嫩艾芙耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3—5401的减毒沙门氏菌ZJ111菌株（ZJ111／pcDNA3—5401）口服接种于3日龄非免疫鸡，2周后进行第2次接种。结果表明．利用该减毒沙门氏菌作为戴体具有相对安全性，用限制性酶切分析和PCR鉴定证实，体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。用ZJ111／pcDNA3—5401（10^4cfu）口服接种非免疫鸡．2周后用相同剂量加强免疫1次，二免后2周用柔嫩艾笑耳球虫孢子化卵囊攻击，观察其免疫效果。结果表明，重组ZJ111／pcDNA3—5401菌既能诱导产生抗鸡柔嫩艾芙耳球虫抗体，也能显著增强淋巴细胞增殖水平（P〈0．05）；其抗球虫指数为164．98。试验结果显示，利用减毒沙门氏菌为戴体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性。     

以减毒沙门氏菌为载体的GM-CSF与生长抑素融合表达质粒对小鼠淋巴细胞增殖和GH及IGF-Ⅰ分泌的影响

40只22日龄小鼠，雌雄各半，平均分为4组。其中第1组为对照组，第2～4组分别经口给予以减毒沙门氏菌为载体的pcS／2SS、pGM—CSF／SS和pGM—CSF＋pcS／2SS DNA疫苗，剂量10^9CFU／只，2周后以相同剂量加强免疫一次，分析不同DNA疫苗对小鼠淋巴细胞增殖和GH、IGF-Ⅰ分泌的影响。结果表明GM—CSF可增强免疫鼠脾淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力，以pGM—CSF／SS免疫组最强；DNA疫苗免疫组的GH和IGF-Ⅰ分泌水平都高于对照组。这些结果证明，GM—CSF对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用，以减毒沙门氏菌为载体介导DNA疫苗通过口服途径免疫动物是一种较好的免疫方式。pGM—CSF／SS的免疫效果优于pGM—CSF＋pcS／2SS。     

减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护

探讨了以减毒鼠伤寒沙门氏茵为栽体传递新城疫病毒DNA疫苗的安全性、免疫原性和可行性。将含新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pcDNA3-F的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111／pcD-NA3一F菌株)，以10^8CFU进行首免，2周后二免，三免后4周攻击强毒株F48E9，观察其安全性和免疫原性，同时设只含空载体pcDNA3的ZJ111／pcDNA3菌株对照及口服PBS对照。结果表明：重组ZJ111／pcDNA3-F菌株具有良好的安全性。对强毒株攻击的保护率达64．7％。重组ZJ111／pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生NDVELISA抗体，而且诱导产生的法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞增殖反应显著高于ZJ111／pcDNA3时照组。这些结果提示，减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将NDVF基因呈递给鸡体细胞进行表达，产生抗NDV的体液免疫，而且还可诱导细胞免疫应答。     

减毒鸡沙门氏菌疫苗株97A安全性评价

鸡白痢（pullorum disease）和禽伤寒（typhus avium）是分别由鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌感染引起鸡的一种败血性疾病，我国对其控制主要采用检疫淘汰的方法，并使用抗生素预防和治疗。但就目前现状而言，采取淘汰清除措施来消灭沙门氏菌，条件还不成熟，加之抗生素治疗也存在诸多弊端，因此，有必要探寻新的防制途径。     

外源基因在减毒沙门氏菌载体中的遗传稳定性和表达

减毒沙门氏菌接种机体后,能够诱导自身及所携带的外源基因免疫,是具有前景的重组疫苗。文章简要介绍了减毒沙门氏菌菌株及外源抗原基因表达产物的免疫应答,重点讨论了提高外源基因在沙门氏菌中的稳定性和表达量这两方面问题。     

沙门氏菌的基因工程减毒以及在DNA疫苗载体中的应用

沙门氏菌是最常见的人畜共患的重要病原菌,引起人和动物肠热症、胃肠炎、败血症等,呈全球性分布.通过基因工程技术对沙门氏菌进行减毒,感染宿主细胞后可在体内长期存活并诱导产生保护性免疫反应.同时,沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌,减毒沙门氏菌运载编码有外源基因的真核表达质粒可在体细胞内进行持续表达,诱导产生特异性的体液和细胞免疫应答.因此,减毒沙门氏菌既可作为针对同源抗原的活疫苗,也可作为诱导针对其他病原微生物产生保护性反应DNA疫苗的载体[1].本文综述了沙门氏菌的基因工程减毒以及在DNA疫苗载体中应用方面的最新进展.     

减毒猪霍乱沙门氏菌作为疫苗及载体的研究进展

猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原之一,同时也是食物中毒的重要病原,因此在养殖业和公共卫生上均有重要意义。本文就其疫苗及疫苗作为载体的研究进展作一综述。     

抑制素与羊GM-CSF基因融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI的构建

为构建抑制素基因与羊GM-CSF基因融合的真核表达质粒,通过EcoRI、XhoI酶切抑制素真核表达质粒pCISI、pEGISI及羊GM-CSF表达质粒pGM-CSF/SS,然后将GM-CSF基因分别插入pCISI、pEGISI,转化DH5α,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,进行酶切和测序鉴定。结果表明,构建的抑制素融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI正确,为研究GM-CSF基因对抑制素基因疫苗的免疫增强作用奠定了基础。     

Improved immune responses against avian influenza virus following oral vaccination of chickens with HA DNA vaccine using attenuated Salmonella typhimurium as carrier

This study evaluates the immune responses of single avian influenza virus (AIV) HA DNA vaccine immunization using attenuated Salmonella enterica sv. Typhimurium as an oral vaccine carrier and intramuscular (IM) DNA injection. One-day-old specific-pathogen-free (SPF) chicks immunized once by oral gavage with 10(9) Salmonella colony-forming units containing plasmid expression vector encoding the HA gene of A/Ck/Malaysia/5858/04 (H5N1) (pcDNA3.1.H5) did not show any clinical manifestations. Serum hemagglutination inhibition (HI) titer samples collected from the IM immunized chickens were low compared to those immunized with S. typhimurium.pcDNA3.1.H5. The highest average antibody titers were detected on day 35 post immunization for both IM and S. typhimurium.pcDNA3.1.H5 immunized groups, at 4.0±2.8 and 51.2±7.5, respectively. S. typhimurium.pcDNA3.1.H5 also elicited both CD4(+) and CD8(+) T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of immunized chickens as early as day 14 after immunization, at 20.5±2.0 and 22.9±1.9%, respectively. Meanwhile, the CD4(+) and CD8(+) T cells in chickens vaccinated intramuscularly were low at 5.9±0.9 and 8.5±1.3%, respectively. Immunization of chickens with S. typhimurium.pcDNA3.1.H5 enhanced IL-1β, IL-12β, IL-15 and IL-18 expressions in spleen although no significant differences were recorded in chickens vaccinated via IM and orally with S. typhimurium and S. typhimurium.pcDNA3.1. Hence, single oral administrations of the attenuated S. typhimurium containing pcDNA3.1.H5 showed antibody, T cell and Th1-like cytokine responses against AIV in chickens. Whether the T cell response induced by vaccination is virus-specific and whether vaccination protects against AIV infection requires further study.     

奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及其活性检测

为了表达奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并对其活性进行检测.根据GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列(U22385),设计一对特异性引物;采用RT-PCR方法,以LPS体外诱导的奶牛肺泡巨噬细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛GM-CSF cDNA基因,克隆到pGEM-T载体中,经酶切鉴定与序列测定,结果显示克隆的奶牛GM-CSF基因与GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.3%.构建pET32a-GM-CSF原核表达重组质粒,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白大小约为35 ku.分别运用集落形成试验与MTT比色法测定重组蛋白活性,结果显示重组奶牛GM-CSF蛋白能够诱导粒细胞前体呈集落性生长并具有较强的体外增殖淋巴细胞的活性,为下一步临床试验奠定了基础.     

携带兔斯氏艾美耳球虫MIC-5基因减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

对携带兔斯氏艾美耳球虫微线蛋白-5基因(MIC-5)真核表达质粒asd-pBMIC-5-IL-15的减毒鼠伤寒沙门菌X4550(X4550/asd-pBMIC-5-IL-15)进行了安全性、稳定性与免疫原性试验.结果显示,重组菌在109CFU剂量以下对家兔安全;连续培养30代重组菌,重组表达质粒可稳定存在于X4550内,具有良好的遗传稳定性;用重组菌2次免疫动物后,既能诱导机体产生抗兔斯氏艾美耳球虫抗体,也能显著增强淋巴细胞增殖水平,抗球虫指数为164.4.试验表明,减毒沙门菌介导的兔球虫调节型DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性.     

Safety and efficacy of an attenuated strain of Salmonella choleraesuis for vaccination of swine.

The purpose of this study was to determine the safety and efficacy of a live Salmonella choleraesuis immunizing strain, obtained by repeated ingestion and recovery through porcine neutrophils. The strain was tested in mice and in pigs. The vaccine was safe and effective in controlled experimental trials, using clinical, pathologic, and microbiologic criteria. Vaccinated pigs were able to maintain normal weight gains during the 4-week observation period following challenge inoculation with a high dose of a virulent strain.     

腺病毒表达鸡GM-CSF及其对鸡骨髓细胞增殖活性的检测

为了方便鸡粒细胞/巨噬细胞集落细胞刺激因子（GM-CSF）作为疫苗佐剂使用,用PCR方法扩增出鸡GM-CSF基因,将其连入人腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,将重组穿梭载体与腺病毒骨架重组后,获得重组腺病毒骨架载体,线性化后转染293SD细胞,获得能够表达鸡GM-CSF的腺病毒。将获得的重组腺病毒转导鸡成纤维细胞系DF1,细胞培养上清中,可以检测到GM-CSF刺激鸡骨髓细胞活性,为鸡GM-CSF进一步应用奠定了基础。     

减毒鸡沙门氏菌97A疫苗株安全性和免疫效力试验

本试验将减毒鸡沙门氏菌97A疫苗株分别以不同剂量经口服和肌肉注射接种10日龄AA肉鸡，结果表明，97A对10日龄雏鸡有良好安全性。将97A分别以10     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.