猪繁殖障碍性疫病多重PCR诊断方法的建立及其应用

根据GenBank已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的序列,经DNAstar生物学软件和BLAST序列分析,利用Oligo6.0软件分别设计并合成了4对特异性扩增引物.在初步优化单项PCR反应退火温度和反应体系的基础上,建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法.结果表明:该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性;对30份临床样品进行检测,结果发现,CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的阳性率分别为46.7%、43.3%、53.4%、10.0%,其中,PRV与PCV2、CSFV与PCV2和CSFV与PRRSV混合感染的阳性率分别为6.7%、36.7%和10.0%;PRV、PCV2和PRRSV单一感染的阳性率分别为3.3%、10.0%和33.3%.说明所建立的多重PCR诊断方法,可以应用于CSFV、PRRSV、PCV2和PRV混合感染所引起的猪繁殖障碍性疫病的临床鉴别诊断.     

云南省猪场猪呼吸道疾病综合征主要病原调查分析

【目的】猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)是引发猪场经济损失的重要原因之一,分析2016—2017年云南省部分地区规模化猪场及散养户间猪呼吸道疾病综合征(PRDC)主要病原的混合感染状况。【方法】通过PCR或RT-PCR对送检病料的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪肺炎支原体(MH)、传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)和副猪嗜血杆菌(HPS) 7种主要病毒性或细菌性病原进行检测。【结果】406份送检样品中,359份为阳性,检出率为88.42%。所检样品中,既有单一携带的,又有混合感染的,PCV2阳性率最高(59.00%);APP阳性率最低(9.09%)。而混合感染以PCV2+PRRSV感染率最高(9.19%),其次为CSFV+PRRSV,感染率为4.46%,PRRSV+PRV和PCV2+MH感染率最低,二者都为0.56%;发现有三重和五重混合感染,以PCV2+CSFV+PRRSV三重感染率最高(2.51%),PCV2+PRRSV+PRV感染率最低(0.28%),CSFV+PRRSV+PCV2+APP+HPS五重感染率为0.28%;未发现四重感染。【结论】PRDC感染情况在云南省广泛存在,且致病病原复杂,所以应加强PRDC感染情况的监测以更有效地防控地方猪疫病发生。     

广西部分地区常见猪群疫病感染情况检测

[目的]检测广西猪群主要疫病的感染状况。[方法]2015年,从发病猪场和屠宰场采集猪组织样品276份,应用RT-PCR方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV),并应用PCR方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)。[结果]发病猪场中,CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒感染率分别为3.98%、11.36%、0、28.98%和4.55%,而屠宰场猪CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒的感染率分别为1.00%、2.00%、0、29.00%和3.00%。对猪群混合感染情况分析发现,PCV2和其他病原的混合感染率最高。其中,发病场二重感染率最高的为PRRSV+PCV2,达到5.11%,其次为PCV2+PRV和PRV+PRRS,阳性率均为0.57%。屠宰场二重感染率最高的是PCV2+PRV,阳性率为1.00%。[结论]在发病猪场和屠宰场中,猪圆环病毒2型的感染率最高,且常与其他病原发生混合感染,伪狂犬病毒感染率较2014年有所下降。     

陕西省PRRSV与CSFV、PCV2、PRV混合感染的检测

运用RT-PCR和PCR技术对高热病期间陕西西安、宝鸡、渭南、榆林、汉中、商洛等地区猪场送检的146 份样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV) 、猪圆环病毒2 型( PCV2) 和猪伪狂犬病毒(PRV)检测.结果显示:被检样品中PRRSV的阳性率达46.6%(68/146);PRRSV与CSFV、PCV2 和PRV 3种病毒均有混合感染现象, PRRSV + CSFV混合感染率为25%(17/68),PRRSV +PCV2为19.1%(13/68),PRRSV + PRV为4.4% (3/68),PRRSV + PCV2+ CSFV为14.7%(10/68), PRRSV + PCV2+ CSFV+PRV为2.9%(2/68).结果表明以PRRSV为主要病原的混合感染在所检测的高热病发病猪群的存在是非常普遍的.     

广西规模猪场主要疫病的流行病学调查与防治

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2005年1~6月间广西36个发生疫病的规模猪场提供的肝、脾、淋巴结、脑等84份组织病料进行猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)、猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬病(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)检测。结果,检出PRRS阳性病料37份,阳性率44%,阳性场17个,场阳性率47%;CSFV阳性病料16份,阳性率11.9%,阳性场6个,场阳性率22.2%;PRV阳性病料27份,阳性率32.1%,阳性场12个,场阳性率33.3%;PCV-2阳性病料44份,阳性率52.3%,阳性场21个,场阳性率58.3%。同时还发现组织病料和发病猪场中存在猪繁殖与呼吸综合症、猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型不同程度的混合感染现象,其中PRRS、PCV-2混合感染最为严重,样品阳性率33.3%,场阳性率25%。表明广西规模猪场主要疫病十分复杂,混合感染现象比较普遍,对广西养猪业带来巨大威胁,应加强疫病的防控工作。     

广西某市猪病毒病的检测与调查

对广西某市以发热、咳嗽、呼吸困难、皮肤及耳朵发绀和高发病率及高病死率等为主要临床特征的39个发病猪场所采集的53份病料进行了主要病毒病的检测。检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性30份,阳性率56.60%(30/53);猪2型圆环病毒(PCV2)阳性25份,阳性率47.17%(25/53);猪流感病毒(SIV)阳性21份,阳性率39.62%(21/53);猪瘟病毒(CSFV)未检出阳性;其中可检出两种以上病原的有29份病料,占54.72%(26/53)。检测结果与调查分析表明,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪2型圆环病毒(PCV-2)和猪流感(SI)是导致该市猪场疾病发生流行的主要病种,而且PRRS、PCV2和SIV常呈多重感染,这为该市发病猪场针对性地做好疫病的防控提供了科学依据。     

PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR的应用研究

采用建立的PCV2-PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,对山东省不同地区送检的32份临床疑似病料进行PCR检测。结果表明:32份样品中,PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV感染的阳性率分别为25.00%、0%、34.38%、71.88%和3.13%;共检出25份阳性病料,阳性率为78.13%,其中PRV-PRRSV双重感染的比例为31.25%,PCV2-PRV-PRRSV三种病原体混合感染的比例为25.00%;用单项PCR检测作对照,结果两者符合率为100%,表明该复合PCR检测方法具有较高的敏感性,可以作为临床上猪圆环病毒2型感染、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟的病原学快速诊断方法。     

华东地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查研究

为了解华东地区猪繁殖与呼吸综合征的感染状况,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)/聚合酶链反应(PCR)方法对2017—2018年在华东地区各大中小规模猪场采集的210份临床样品进行病原学检测(肺、脾、淋巴结等),并对分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行测序,由于2017—2018年江苏、安徽和福建一些中小养殖场发生小规模的流产死胎,因此也对其他一些相关常见病毒[如猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)]进行了检测,以确定导致流产死胎的主要原因以及猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和流行毒株。结果表明:210份样品中,PRRSV阳性样品78份,阳性率为37.1%;PCV2阳性样品189份,阳性率90.0%;PRV阳性样品5份,阳性率2.4%;CSFV阳性样品0份,阳性率0。在这些阳性样品中,福建、浙江、上海、江苏、安徽、江西和山东等地区抗原阳性率有所差别,但都以PRRSV和PCV2为主。通过此次调查了解了华东地区猪繁殖与呼吸综合征的基本流行情况,为今后猪繁殖与呼吸综合征的防控提供了参考。     

云南省勐腊县猪场PCV2和PCV3的感染状况

为更好地了解和监控云南省勐腊县猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的感染情况,应用PCR方法对2019年采集自该地区部分猪场的86份(血液样品59份,粪便样品27份)样品进行PCV2、PCV3抗原检测。结果表明:PCV2阳性检出率为36.05%,PCV3阳性检出率17.44%,二者混合感染率为15.12%。PCV2和PCV3在勐腊县呈一定的流行趋势,且混合感染率较高,应加强对该病的防控。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析(英文)

[目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。CSFV和PCV2的鉴定:间接免疫荧光法操作。PRRSV的鉴定:由于PRRSV可致Marc-145细胞发生病变,故可由细胞病变与否作出初步鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

猪瘟病毒RT-nested PCR检测方法的优化和应用

为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳性毒和健康猪脾、肝组织及阴性PK-15细胞均未扩增出特异性条带,说明该方法特异性强。应用此方法对福建省133份病料进行检测,结果有60份病料为阳性,阳性率为45.1%。结果提示优化的检测方法灵敏度高,特异性强;福建省猪群CSFV感染率高,需要加强CSF预防控制工作。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的流行病学调查

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)在我国猪场混合感染的发病情况,根据Gen Bank中PRRSV ORF5及PCV2 ORF1基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PCV2的RT-PCR及PCR方法,对2013—2015年采自吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省192份样品进行检测。结果发现:PRRSV感染率为22.9%,PCV2感染率为64.3%,28份样品为混合感染阳性,阳性率达14.58%。猪群中PRRSV和PCV2的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析

[目的]鉴定由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭（编号为HN/XT）发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

台州地区规模猪场主要疫病的流行病学调查

选取浙江台州地区规模猪场为试验猪场,从2014年到2016年用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬野毒(PRV g E)抗体的阳性率,分析猪群免疫状况。同时采取临床可疑病料,用PCR及RT-PCR技术检测PRRSV、PCV2、SFV和PRV的感染率。结果显示:从2014年到2016年CSFV抗体阳性率从64.9%上升到80.4%;PRRSV和PCV2抗体阳性率变化不大,均处于高位;PRV g E抗体阳性率从52.5%下降到22.9%。在不同年龄段猪群中,母猪抗体水平最高,仔猪抗体水平逐渐下降,保育猪最低,抗体阳性率下降到50%以下,肥育猪阶段又有所回升。在病原检测中,2014年PRRSV、PCV2、SFV和PRV4种病原检出率均较高,其中PCV2检出率高达60%,到2016年4种病原检出率均下降到15%以下。本实验结果为控制猪场疫病和完善猪群免疫程序等防治措施提供了科学依据。     

浙江部分地区猪瘟流行现状的调查与分析

为了解当前浙江省猪瘟流行情况,对浙江省8个地市的18个疑似猪瘟发病场的流行病学资料进行调查与分析。结果表明,浙江省猪瘟以非典型为主,典型猪瘟也同时存在,绝大多数都是在外界诱因（如长途运输、去势、注苗）诱导或其他病原感染下发生,多为3月龄以内仔猪发病且病程较长。母猪存在隐性感染,部分表现为繁殖障碍,一些临床健康猪存在带毒问题。此外,从疑似猪瘟的38份病料中检出猪瘟病毒（CSFV）、猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCVⅡ）,检出率分别为47.37%,44.7%和23.68%;而PRRSV、PCVⅡ分别与CSFV的混合感染率为33.3%和11.1%。分子流行病学调查结果表明,浙江猪瘟流行株与CSFV石门毒株（Shimen株）和CSFV兔化弱毒株（HCLV株）2个传统毒株的E2核苷酸同源性分别为81.2%～83.0%和83.1%～84.0%,与不同厂家的弱毒疫苗株核苷酸同源性为81.7%～82.6%,说明浙江省猪瘟流行株正朝远离疫苗毒发展并呈现遗传多样性。     

安徽省部分猪场猪圆环病毒2型和3型感染情况调查

[目的]调查安徽省猪圆环病毒的感染情况。[方法]2018年,采用荧光定量PCR方法对来自安徽省3个地区12个猪场健康猪群的239份扁桃体样品进行了PCV2和PCV3检测。[结果] PCV2个体阳性率为67.4%(161/239)、群体阳性率为91.7%(11/12),PCV3个体阳性率为14.6%(35/239)、群体阳性率为58.3%(7/12),PCV2/PCV3混合感染个体阳性率为5.0%(12/239)、群体率阳性为41.7%(5/12)。不同生长阶段、不同地区和不同规模的生猪PCV2、PCV3及PCV2/PCV3混合感染存在差异。育肥猪PCV2感染率最高(84.3%),能繁母猪PCV3感染率(51.9%)及PC2/PCV3混合感染率(14.8%)最高;C地区PCV2感染率最高(89.9%),B地区PCV3感染率(36.2%)及PC2/PCV3混合感染率最高(8.8%);中型猪场PCV2感染率最高(82.2%),大型猪场PCV3感染率(38.3%)及PC2/PCV3混合感染率最高(10.0%)。[结论]安徽省猪群中存在PCV2和PCV3流行,需引起足够重视。     

PCV与PEDV混合感染的实验室检测

对采自湖北省内16家规模化养猪场的650份组织样品分别进行猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的病原学检测.结果表明:除PCV4未检出阳性外,PCV1、PCV2、PCV3、PEDV单一感染的样品阳性率分别...     

RT-PCR和免疫荧光抗体试验检测猪瘟病毒的比较研究

根据已发表的CSFV序列合成1对引物,以猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株为模板,建立并优化了检测CSFV的RT-PCR方法,并与直接荧光抗体试验(DFA)进行比较,检测了15份临床疑似病料。结果如下:应用RT-PCR对CSFV兔化弱毒株RNA进行扩增,获得与预期大小相符长为509 bp的特异性目的片段,敏感性达到10 pg的CSFV-RNA,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪2型圆环病毒(PCV2)进行同条件扩增均为阴性,RT-PCR产物测序结果与文献报道的CSFV不同毒株的核苷酸序列同源性达到95%~99%;15份临床疑似病料应用RT-PCR的检出率为66.7%,而应用免疫荧光试验的检出率为60.0%,二者的总符合率为80%。表明RT-PCR方法比DFA更敏感,两种方法均可用于猪瘟的快速诊断。     

猪圆环病毒2型快速直接PCR检测方法的建立与流行病学调查

为了解河南省猪圆环病毒2型(PCV2)的流行病学情况,参考Gen Bank的PCV2 ORF2的序列,设计1对引物,建立PCV2的快速直接PCR检测方法,并进行特异性和敏感性试验。运用该方法对2016年5月至2017年5月采集到的河南省共125份疑似猪圆环病毒2型的病料进行PCV2检测,阳性样品测序,分析河南省PCV2的遗传变异情况。结果显示,建立的PCR检测方法快速、特异、敏感,适用于临床检测或流行病学调查;所检测的125份样品中,55份样品为PCV2阳性,阳性率高达44%。阳性结果序列分析显示,核苷酸序列同源性在88.7%~99.8%,42份在PCV2b基因群。结果表明,河南省PCV2感染率较高,PCV2b为流行血清亚型,病毒变异严重。