细粒棘球蚴细胞系（13G—5）细胞代谢抗原的免疫性和反应原性

应用培育成功的人源细粒棘球蚴细胞系（１３Ｇ－５）细胞的天然代谢抗原,接种昆明小鼠,于接种后第１４天给免疫小鼠接种人源细粒棘球蚴原头节约１０００个,于２００天剖检观察有无包囊形成,病理切片鉴定;并用该抗原作为诊断怕,使用间接血凝（ＩＨＡ）、琼脂扩散（ＡＧＤ）试验,检测临床确诊的细粒棘球蚴病人血清,以多房棘球细病人血清、细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清作为对照。结果表明,该抗原能使６０％的小鼠获工抗细粒棘     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT—PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA，并亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上，转化至大肠埃希氏菌BL21，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明，从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA，序列长度为481bp，包括471bp的开放阅读框，与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致；SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒产生了约42ku的目的带，其中EG95蛋白质的分子质量约为15．2ku，与预期结果一致；Western-blotting试验检测表明，融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示，EG95基因高度保守，所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原的研究：六钩蚴排泄分泌抗原的反应原性

本实验应用体外培养方法制备细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌（ＥＳ）抗原，应用酶联兔疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）首次对六钩蚴ＥＳ抗原的反庆原性进行了初步分析。以５μｇ／ｍｌ包被反应板分别与已知阳性，阴性血清；人工感染血清；免疫血清；疫区屠宰绵羊血清；肝片吸虫，细颈囊尾蚴以及边虫感染的绵羊添反应，结果表明六钩蚴ＥＳ抗原具有较好的反庆原性。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析以抗原有一定的纯化作用。纯化六钩蚴ＥＳ抗原可     

细粒棘球蚴细胞系(13G-5)细胞代谢抗原的免疫原性和反应原性

应用培育成功的人源细粒棘球蚴细胞系(13G-5)细胞的天然代谢抗原,接种昆明小鼠,于接种后第14天给免疫小鼠接种人源细粒棘球蚴原头节约1 000 个,于200 d 剖检观察有无包囊形成,病理切片鉴定;并用该抗原作为诊断抗原,使用间接血凝(IHA)、琼脂扩散(AGD)试验,检测临床确诊的细粒棘球蚴病人血清。以多房棘球蚴病人血清、细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清作为对照。结果表明,该抗原能使60% 的小鼠获得完全抵抗细粒棘球蚴原头节攻击的能力,未完全获得保护的小鼠形成包囊的数量、大小较对照组明显减少,且为不育囊;使用该抗原IHA 检测31 份血清,阳性24 份,阳性率77.42% ,AGD检测30 份血清,阳性13 份,阳性率43.33% ,2 种方法对多房棘球蚴病人血清和细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清不起反应。     

青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析

从青海省羊源细粒棘球蚴中提取基因组DNA，用EG95特异性引物进行PCR扩增，并克隆至pGEM-T Easy载体上，经PCR、EcoRⅠ酶切和测序鉴定后，用DNAstar软件对3个克隆的DNA序列进行同源性分析。结果表明，EG95基因的3个序列(EG95-QH-1、EG95-QH-2和EG95-QH-3)的片段大小为1435～1437 bp。与GenBank中的EG95基因同源性为73．2％～99．2％，差异集中在内含子区域。其中EG95-QH-1、EC-95-QH-3与GenBank EG95XJ-ag、EG95-4序列的同源性较高；EG95-QH-2与GenBank中EG95-1、EG95-2、EG95-3序列的同源性较高。研究结果表明，青海羊源细粒棘球蚴EG95基因的3个序列为EG95基因家族的成员。     

细粒棘球蚴病诊断抗原研究进展

细粒棘球蚴病严重危害人畜健康,给畜牧业造成巨大经济损失。该病的早期诊断有很重要的意义。囊液抗原、原头节抗原和囊壁抗原等天然抗原是用于该病诊断的主要抗原,但存在敏感性差、特异性弱等缺点。近年来,人们合成了AgB、Ag5、EpC1、EgTPx等重组抗原,将其用于诊断,并获得了较高的敏感性和特异性。论文将用于诊断的天然抗原和重组抗原进行了综述。     

分泌抗细粒棘球蚴原头节可溶性抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用ＳＰ２／０骨髓瘤细胞与以羊源细粒棘球蚴原头节可溶性抗原免疫的Ｂａｌｌ／ｃ鼠脾细胞融合，经克隆和筛选后获得８株分泌抗ＳＰＡ的杂交瘤细胞株，即３Ａ４，１ＩＣ２，２Ｂ３，２Ｃ２，２Ｅ３，３Ｅ６，３Ｆ１０和２Ｃ２。亚类鉴定为ＩｇＧ１（３Ａ４，３Ｅ６，１Ｃ２，３Ｆ１０和３Ｃ２），ＩｇＧ２ｂ（２Ｃ２），ＩｇＧ３（２Ｅ３），ＩｇＧ总（２Ｂ３）。免疫双扩散法显示２Ｃ２腹水及２Ｂ３，２Ｃ２，２Ｅ３培养上清粗提物与     

分泌抗细粒棘球蚴原头蚴抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用感染包虫的绵羊肝包囊中的活原头蚴腹腔接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，８个月后取鼠脾细胞与Ｓｐ２／ｏ骨髓瘤细胞融合。经ＩＨＡ筛选，获得１４个阳性杂交瘤细胞株，对其中３株进行了克隆和进一步研究。结果表明，５Ｃ５与细颈囊尾蚴、脑包虫和肝片吸虫抗原均不发生交叉反应，腹水抗体的ＩＨＡ效价为１：２０４８，属ＩｇＧ２ｂ亚类：３Ｃ５和６Ｃ４与细颈囊尾蚴和脑包虫有轻度交叉反应，腹水抗体的ＩＨＡ效价为１：１２８，均属ＩｇＭ类。     

细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆

为筛选细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究.以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析.ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Westem blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原.筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1～2kb之间.对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%.筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因.     

细粒棘球绦虫TPx基因的克隆及序列分析

从自然感染病羊肝内收集细粒棘球绦虫（Eg）原头蚴,分别提取总RNA和基因组DNA。根据GenBank数据库中的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因序列设计1对引物,以总RNA为模板,采用RT—PCR技术扩增出EgTPx基因片段,同时以基因组DNA为模板扩增出对应的基因组序列。PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5口后,进行序列测定和生物信息学分析。结果表明,成功扩增到中国青海株细粒棘球绦虫EgTPx基因片段,其开放阅读框为582bp,编码193个氨基酸,与已知的EgTPx基因核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的同源性均为99％,有3个碱基发生变异,分别在245,306,318位由C变为T;引起1个氨基酸变异,由Ala^82变为Val^82。EgTPx具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点Cys^48和Cys^169。,以及周围保守的FVCP和VCPA序列。EgTPx基因的开放阅读框对应的基因组序列包含2个外显子和1个69bp的内含子。     

细粒棘球蚴SmadA基因的克隆及其功能的初步鉴定

本研究旨在克隆细粒棘球蚴Smad蛋白家族基因EgSmadA,鉴定其结构及表达部位,并建立酵母双杂交体系.利用生物信息学方法,克隆及分析EgSmadA基因的DNA全长序列,采用免疫组化技术鉴定EgSmadA蛋白的表达及分布,并构建该基因酵母双杂交载体.结果表明,成功扩增出EgSmadA基因组序列全长4 069 bp,包含4个外显子和3个内含子,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸,该蛋白C端含有Smad蛋白家族进化高度保守的典型结构域MH2 (Mad homology),并成功构建该基因及其MH2结构域的酵母双杂交载体.免疫组化定位该蛋白主要表达于原头蚴被膜及囊泡生发层.研究结果为进一步研究EgSmadA在细粒棘球蚴生长发育中的作用奠定了基础.     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础.将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定.同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测.结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性.同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性.EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础.     

克隆、原核表达和鉴定牛重组SHH蛋白

Sonic Hedgehog(SHH)是Hedgehog家族的一员,其不仅参与胚胎发育的基本过程,同时也参与脂肪生成和肌肉生成。SHH在动物肌肉和脂肪沉积上的双向作用提示它是调控肌内脂肪含量(IMF)的重要候选基因。本研究中,使用重叠PCR法克隆了去除信号肽序列的牛SHH(btSHH)基因,然后在大肠杆菌BL21中诱导表达了btSHH蛋白。使用镍亲和层析试剂盒纯化了原核表达的btSHH,并用Western blot验证了目标蛋白的正确性。将纯化后的btSHH添加到前脂肪细胞3T3-L1的培养基中,并诱导细胞分化后表明,重组btSHH蛋白能够显著地抑制脂肪沉积过程。本研究结果为未来肉牛生产中应用btSHH提供理论基础。     

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原，根据其基因序列设计合成了1对特异性引物，对CaPVP32基因进行了PCR扩增，产物大小约为969bp；产物回收纯化后，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞，与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99％；相应地，氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆，该重组菌株经L—arabinose诱导，可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约51．53ku．     

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析,为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增,将其克隆到p MD-18T并与p Chlamy-4载体相连,重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白,结果可得:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原,鼠抗IHNV血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗,再次进行Westen Blot检验,其结果显示,经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应,并在58 k Da处出现了一条明显的特异性条带,具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。     

细粒棘球绦虫抗原B的研究进展

细粒棘球绦虫抗原B(AgB)是血清学诊断棘球蚴病最重要的抗原,也是目前研究最多的抗原之一。深入研究抗原B对棘球蚴病的血清学诊断、流行病学研究、综合防控和疫苗的研究开发具有重要的意义。文章针对近年来关于抗原B的分子生物学特征、免疫学特性及在人和动物等中间宿主的血清学诊断方面的研究进展进行综述。     

细粒棘球绦虫幼虫——原头蚴感染比格犬(Beagle)试验

以比格犬为实验动物经口感染原头蚴,观察细粒棘球绦虫的感染情况.6只比格犬分为3组,每组2只,每组感染原头蚴的剂量分别为5万、15万、25万枚/只,感染后40 d开始检查粪便有无虫卵排出.结果显示:人工感染原头蚴后48 d虫体开始排卵;6只比格犬(Beagle)细粒棘球绦虫人工感染率为100%,其中5万枚组感染的平均荷虫3 457条(成熟2 074条,未成熟1 383条);15万枚组感染的平均荷虫6 230条(成熟3 639条,未成熟2 591条);25万枚组感染的平均荷虫16 238条(成熟11 856条,未成熟4 382条).结果表明,比格犬(Beagle)可以成为感染细粒棘球绦虫研究的动物模型.     

新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究

为了探明新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因型,根据GenBank公布的12S rRNA基因和CO1基因分别设计特异性引物,对58个绵羊细粒棘球蚴包囊进行PCR检测,再通过CO1特异性引物对检测阳性病料进行PCR扩增、测序及基因分型。通过12SrRNA基因检测发现58份样品均为阳性;对所测得的58条CO1基因序列分析,发现新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因型均为G1型,且CO1基因序列存在多态性,为塔城地区绵羊细粒棘球蚴病的防控提供了科学依据。     

Viability of Echinococcus granulosus protoscolices at different conditions

The aim of this study was to examine the longest survival time of Echinococcus granulosus protoscolices stored at different humidities and constant temperatures from -10 to +40 degrees C. Sheep livers containing hydatid cysts obtained from slaughterhouses were taken to the laboratory within 3h and transferred into incubation cabinet previously set at -10, 0, +10, +20, +30 and +40 degrees C with different relative humidity (RH). Viability of protoscolices was assessed by 0.1% eosin staining. The longest survival times were 3 days at -10 degrees C (50% RH), 36 days at 0 degrees C (60% RH), 28 days at 10 degrees C (65% RH), 12 days at 20 degrees C (70% RH), 4 days at 30 degrees C (75% RH) and 3 days at 40 degrees C (80% RH).