小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响

旨在研究色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)与黑色素合成调控因子之间的互作关系,探索PEDF对黑色素细胞活力和黑色素合成的调控作用,为研究动物毛色形成机制提供基础。本研究将PEDF siRNA及PEDF过表达载体分别转染小鼠黑色素细胞,对黑色素细胞活力、黑色素含量进行检测,采用qRT-PCR、Western blotting及细胞免疫荧光对PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达和定位进行检测。黑色素细胞PEDF沉默后,黑色素细胞的细胞活力增强,黑色素含量增加,Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量升高;黑色素细胞PEDF过表达后,黑色素细胞活力减弱,黑色素含量减少,Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量降低。细胞免疫荧光结果显示：PEDF、Wnt1、MITF、β-catenin表达于黑色素细胞的细胞质;Wnt3α表达于黑色素细胞的细胞质和细胞膜。本研究证实：PEDF使黑色素细胞活力减弱,可通过下调促黑色素生成相关的因子Wnt1、W...     

CDK5对羊驼皮肤黑色素细胞TYR和MITF mRNA表达的调节

为了证实CDK5是否参与羊驼毛色的形成,本研究主要对CDK5在羊驼黑色素细胞中调节TYR和MI TF的表达进行了研究.本研究首先采用免疫组织化学方法检测CDK5在羊驼皮肤黑色素细胞中的定位,再通过脂质体将CDK5转染于羊驼皮肤黑色素细胞,之后通过Western blot和qRT-PCR的方法检测转染后黑色素细胞中CDK5蛋白、TYR和MITF mRNA的表达.免疫组化结果显示CDK5位于黑色素细胞的胞质和细胞核内;Western blot结果显示转染组黑色素细胞中CDK5蛋白表达量明显高于对照组;qRT-PCR结果显示CDK5可下调MITF的表达,同时上调TYR的表达,转染组黑色素细胞中MITF和TYR mRNA的表达水平分别是对照组细胞的0.264 9和3.931 3倍.结果揭示CDK5可能通过调节黑色素细胞核中TYR和MITF mRNA的表达,从而参与调控羊驼毛色形成.     

Nkx2-5基因的克隆及其与黑色素细胞黑色素生成相关性的研究

本实验旨在探究Nkx2-5基因在小鼠黑色素细胞中是否表达,同时通过生物信息学的方法预测其是否与调控黑色素生成的基因有相互作用。结果表明:转录因子Nkx2-5在小鼠黑色素细胞中表达,其编码的蛋白作为转录因子与下游基因作用的主要位点在144~196位氨基酸残基处,且其在黑色素生成中的关键基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的启动子中都有作用位点,同时Nkx2-5蛋白与对神经嵴分化有重要影响的Hand1、Hand2存在相互作用,故可以推测转录因子Nkx2-5在黑色素细胞的黑色素生成中发挥着重要的作用,进而为从分子水平解释动物被毛白化的发病机理提供新的思路。     

水貂被毛黑色素含量及皮肤成熟黑色素细胞组织学分析

旨在分析水貂被毛黑色素含量差异及观察皮肤成熟黑色素细胞的分布特征,为水貂毛色形成调控机理研究提供理论依据。以乌贼黑为标准品,利用酶标仪测定并比较金州黑水貂、银蓝水貂和吉林白水貂被毛总黑色素(Total melanin,TM)、真黑色素(Eumelanin,EM)及褐黑色素(Pheomelanin,PM)含量;通过甲苯胺蓝、多巴及多巴联合甲苯胺蓝分别对不同毛色水貂皮肤组织进行染色。结果表明,金州黑水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分别是换毛期的1.17和1.20倍(P0.01),EM含量显著高于换毛期(P0.05);银蓝水貂换毛期与毛皮成熟期被毛3种黑色素含量差异不显著(P0.05);吉林白水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分别是换毛期的1.27和1.22倍(P0.05)。组织学染色显示,金州黑和银蓝水貂皮肤中均存在成熟黑色素细胞,主要分布于金州黑水貂的表皮和毛囊顶端,毛囊外根鞘和毛纤维髓质层有少量多巴阳性着色带;银蓝水貂皮肤的表皮和毛囊顶端多巴阳性着色带较少,毛囊外根鞘阳性着色较浅;吉林白水貂皮肤组织未见明显多巴阳性着色区域。综上表明,PM含量可能与水貂灰色和白色被毛表型相关,毛囊顶端的成熟黑色素细胞可能是水貂被毛色素沉积的主要细胞。     

小鼠皮肤组织原代黑色素细胞培养条件的优化

为了优化小鼠原代黑色素细胞培养条件,试验以出生1 d的小鼠背部皮肤组织为材料,在培养过程中分别比较不同消化时间、是否向培养基中添加鼠尾胶原蛋白、首次换液时间对原代黑色素细胞培养的影响,通过观察黑色素细胞形态和生长状态以及台盼蓝染色计数细胞研究小鼠黑色素细胞的原代培养条件。结果表明:小鼠原代黑色素细胞的培养条件为消化时间10 min、培养基使用含鼠尾胶原蛋白的培养基、首次换液时间24 h,可以获得大量处于良好生长状态的黑色素细胞。说明小鼠原代黑色素细胞培养条件优化成功。     

IFN-γ对羊驼皮肤黑色素细胞增殖和黑色素合成的影响

旨在研究IFN-γ对黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响。不同浓度IFN-γ(0.0、0.5、2.0、8.0、16.0、32.0、64.0ng·mL-1)分别处理羊驼皮肤黑色素细胞24、48和72h。MTT法检测黑色素细胞活力,紫外分光光度法检测黑色素含量,qRT-PCR检测MC1R、TYR、TYRP1、MITF、DCT及NOS2mRNA水平的变化。结果显示,24h黑色素细胞活力受到抑制,72h细胞活力恢复且黑色素合成增强;IFN-γ可促进黑色素含量的增加,以32.0ng·mL-1 IFN-γ增加极显著。TYRP1、MITF、DCT、NOS2mRNA相对表达量显著增加(P0.05),MC1R、TYR mRNA相对表达量增加不显著(P0.05)。IFN-γ可促进黑色素细胞树突增长,可能有助于黑色素的转运;IFN-γ诱导黑色素的合成,可能与黑色素细胞中NOS2和MITF的高表达有关,可能通过NO/cGMP/PKG介导的信号通路合成黑色素。     

非转移性黑色素瘤糖蛋白B对小鼠黑色素细胞色素生成的影响

旨在探索非转移性黑色素瘤糖蛋白B(GPNMB)在不同毛色小鼠皮肤是否存在差异性表达,确定其对黑色素生成的影响。随机选取C57BL/6J品系出生12d的黑、棕、灰小鼠各3只,背部剪毛后,每只小鼠各取3块皮肤组织,采用免疫组织化学检测,结果表明,GPNMB在不同毛色小鼠皮肤的毛基质、内外毛根鞘、毛乳头等区域均有表达。利用Western blot和qRT-PCR方法分析,结果显示,灰色小鼠皮肤中GPNMB表达量最低。过表达GPNMB后,与空载体组相比,MC1R、β-catenin和SLC45A2相对表达量显著升高;用紫外线B(UVB)处理黑色素细胞,同时检测GPNMB和MC1R的表达量变化。结果表明,UVB对GPNMB和MC1R有影响,并且不同剂量UVB辐射对GPNMB影响不同。综上表明,GPNMB在不同毛色小鼠皮肤存在差异性表达,并且通过影响黑色素细胞色素的生成进而参与毛色的生成。     

RNAi对羊驼黑色素细胞中MC1R表达量及黑色素合成的影响

旨在研究RNAi对羊驼黑色素细胞中MC1R表达量及黑色素合成的影响。合成3对MC1RsiRNA,将MC1RsiRNA瞬时转染羊驼黑色素细胞,qRT-PCR法检测MC1R mRNA表达量,细胞免疫组化技术对MC1R进行定位,利用吸光度值检测黑色素细胞中黑色素的合成量。结果显示,siRNA2组和siRNA3组的MC1R mRNA相对表达量极显著低于空白对照组(P0.01),siRNA1组和阴性对照组与空白对照组相比差异不显著(P0.05),siRNA2、siRNA3两组的黑色素合成量低于空白对照组,差异极显著(P0.01)。将MC1RsiRNA成功转染到羊驼黑色素细胞中,筛选出有效MC1RsiRNA,MC1R的抑制情况与黑色素合成量一致,说明黑色素细胞中MC1R对黑色素的合成具有调控作用,其作用机制需进一步研究。     

不同肤色山羊皮肤组织形态学及黑色素生成相关基因的表达分析

旨在阐明酉州乌羊皮肤发育的组织形态学特点以及黑色素高度沉积的可能分子机制,本研究选取渝东白山羊(白色皮肤)为对照,对100日龄酉州乌羊和渝东白山羊胎儿皮肤组织进行了组织形态学分析;并检测了成年酉州乌羊和渝东白山羊皮肤组织以及B16黑色素细胞增殖、分化阶段Pax3、Mitf与Tyr的表达变化。结果表明,在山羊胎儿皮肤快速发育阶段,两品种间皮肤黑色素沉积差异明显;Pax3与Tyr在酉州乌羊皮肤中表达量显著高于渝东白山羊(P0.001),而Mitf则无明显差异(P0.05);相对于细胞增殖阶段,B16细胞在分化时Pax3表达显著下调(P0.001),Tyr的表达显著上调(P0.01),而Mitf无明显差异(P0.05)。研究结果提示,在皮肤发育分化的早期阶段,酉州乌羊与渝东白山羊黑色素细胞的迁移路线可能不同;Pax3下调与Tyr上调是色素细胞分化并生成黑色素的必要条件;酉州乌羊皮肤黑色素高度沉积与Pax3、Tyr的大量表达有关。     

Wnt3a在小鼠黑色素细胞中的表达研究

Wnt3a 在小鼠黑色素细胞的早期分化、迁移及黑色素合成过程中发挥重要作用。本研究通过免疫荧光技术检测体外培养的小鼠黑色素细胞中的 Wnt3a 蛋白的表达,为深入研究其在黑色素生成中的作用奠定基础。     

酪氨酸酶转运对黑色素生成影响研究进展

哺乳动物毛色的形成依赖于黑色素细胞中黑色素数量及分布比例,酪氨酸酶类(TYR/TYRP1)的转运及其活性是黑色素合成的关键。衔接蛋白(AP-1/3)和溶酶体相关细胞器生物合成复合物(BLOC-1,2,3)将TYR/TYRP1从早期核内体转运至黑素小体,若TYR/TYRP1无法转运至黑素小体中,黑色素合成则会受到抑制。ATP7A将铜离子转移到TYR/TYRP1,从而激活TYR/TYRP1活性,ATP7A的减少同样会使黑色素细胞中黑色素合成量减少。关注这些复合物在转运TYR/TYRP1的作用及影响其活性的因素,可以从不同的角度解析黑色素合成机理,以此为基础探索哺乳动物毛色的淡化机制,以期为阐明人类黑色素合成障碍的相关疾病提供理论依据。     

优质肉鸡不同胫色皮肤组织形态学及黑色素生成相关基因的表达分析

为阐明优质肉鸡胫皮肤发育的组织形态学特点,以及黑色素高度沉积的分子机制,选取2～10周龄S3系(黑色胫)和L系(黄色胫)肉鸡胫皮肤组织,进行组织形态学分析,并检测不同胫色的胫皮肤组织中Pax3、Mitf与Tyr基因的表达。结果显示:在优质肉鸡快速生长阶段,两品系间胫皮肤黑色素沉积差异明显,S3系胫皮肤黑色素数量呈波动性变化,2～6周龄时逐渐增加,而后逐渐减少,但同周龄之间S3系胫皮肤黑色素的数量极显著大于L系(P0.01)。不同胫色鸡胫皮肤黑色素面积均随周龄的增加而增加,但L系胫皮肤黑色素随面积极显著小于S3系(P0.01)。Pax3与Tyr在S3系胫皮肤中表达量显著高于L系(P0.001),而Mitf则无明显差异(P0.05)。结果表明:在胫皮肤发育分化过程中,S3系与L系胫皮肤黑色素细胞的迁移、黑色素细胞的分裂成熟、黑色素小体的形成、黑色素颗粒的转运路线可能存在差异;胫皮肤黑色素高度沉积与Pax3、Tyr的表达有关,Pax3下调可以促进Tyr的表达,进而使黑色素细胞黑色素的生成增加。     

miR-27a-3p对绵羊皮肤黑色素细胞中Scf表达的影响

目的:旨在研究miR-27a-3p对黑色素细胞中Scf(stem cell factor)表达的影响,从而明确miR-27a-3p对黑色素生成的影响。方法:将miR-27a-3p mimic(模拟物)、(抑制物)及各自对应的阴性参照物(mimic NC(negative control),inhibitor N C)分别转染绵羊皮肤黑色素细胞,荧光定量PCR和Western Blot测定转染48h后绵羊黑色素细胞中的Scf mRNA和蛋白的表达量。结果:与对照组相比,转染mimic的黑色素细胞中,Scf mRNA和蛋白的表达量都极显著地减少(p0.01),而转染miR-27a-3p inhibitor的黑色素细胞中,Scf mRNA和蛋白的表达量极显著增多(p0.01)。结论:miR-27a-3p抑制绵羊皮肤黑色素细胞中Scf的表达。     

山羊皮肤组织miRNA测序与miR-129-5p调控黑色素生成的功能研究

旨在筛选对黑色素生成起调节作用的小RNA,并探究其对山羊肤色及毛色的调控机制。本研究采集了健康酉州乌羊(Youzhou dark goat, YZDG)、川东白山羊(Chuandong white goat, CDWG)100日龄胎羊皮肤样本(n=3),和健康2～3周岁大足黑山羊(Dazu black goat, DBG)、内蒙古绒山羊(Inner Mongolia cashmere goat, IMCG)个体皮肤样本(n=3),利用组织切片染色技术观察皮肤中黑色素沉积情况;通过小RNA测序技术筛选差异miRNAs;培养B16-F10皮肤黑色素瘤细胞,利用细胞转染、qPCR、Western Blot、黑色素含量检测等技术验证miR-129-5p对黑色素生成的影响。结果显示,黑色素颗粒明显在YZDG胎羊皮肤和DBG毛囊的毛球、毛干、外根鞘等部位沉积,而在CDWG胎羊皮肤和IMCG表皮、毛囊中没有被观察到。经测序分析,在肤色差异的YZDG和CDWG中筛选到62个差异表达miRNAs,其中31个在乌皮山羊中上调,31个下调。在毛色差异的DBG和IMCG中,筛选到38个差异表达miRNAs,其...     

过表达miR-193b对黑色素细胞中MITF和TYR表达的影响

旨在探讨miR-193b对黑色素生成关键基因MITF和TYR表达的影响,进而说明miR-193b对黑色素形成的影响。本研究通过细胞转染技术,在绵羊黑色素细胞中过表达miR-193b,检测黑色素细胞中黑色素含量的变化,采用实时荧光定量PCR和Western blot分别对转染细胞中MITF和TYR mRNA和蛋白表达水平进行测定。结果显示:过表达miR-193b的黑色素细胞,黑色素含量明显减少;MITF mRNA和TYR mRNA表达均显著降低(P0.01),分别降低0.233倍和0.198倍;MITF和TYR蛋白表达量也显著降低(P0.01),分别降低0.232倍和0.321倍。本研究表明,过表达miR-193b使黑色素细胞中MITF和TYR表达量降低而间接影响黑色素生成。     

酉州乌羊皮肤黑色素含量和结构分析

为了分析酉州乌羊皮肤黑色素含量和结构,试验随机选择均匀度一致的6月龄酉州乌羊11只和板角山羊3只,采用酶解提取法测定皮肤黑色素含量,并通过红外光谱法对黑色素及其氧化降解物可溶性部位的红外光谱学性质进行研究。结果表明:酉州乌羊皮肤中黑色素含量为(0.218 5±0.007 5)%,板角山羊皮肤中黑色素含量为(0.023 7±0.001 2)%,二者差异极显著(P0.01)。酉州乌羊皮肤中的黑色素具有天然黑色素的典型红外特征并且结构中存在苯环、烷基、羧基、羟基及氨基等官能团,初步判定为具有吲哚结构的真黑色素。     

α-黑素细胞刺激素对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响

旨在研究α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响,初步探讨α-MSH调控泰和乌骨鸡黑色素合成的机制。利用体外培养的乌骨鸡皮肤黑色素细胞,观察不同质量浓度α-MSH(0、2.5、5、10 mg/L)及其拮抗剂([D-Trp7,Ala8,D-Phe10]α-MSH(6-11)-amide,D-AD-MSH)处理后黑色素细胞增殖、黑素皮质素受体1(melanocortin 1receptor,MC1R)基因表达、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量和黑色素含量的变化。结果表明,不同质量浓度的α-MSH对细胞有促增殖的作用,2.5mg/Lα-MSH处理组细胞的增殖率极显著高于不添加α-MSH的对照组(P0.01)。α-MSH剂量依赖性地提高MC1R基因表达。2.5mg/Lα-MSH处理组细胞cAMP的含量显著高于对照组(P0.05),其他处理组之间差异不显著(P0.05)。不同浓度的α-MSH处理均极显著提高细胞TYR活性(P0.01或P0.05)。与对照组相比,2.5mg/Lα-MSH极显著提高皮肤黑色素细胞的黑色素含量(P0.01),5、10.0mg/Lα-MSH具有提高黑色素细胞黑色素含量的趋势(P0.05)。α-MSH拮抗剂D-A-D-MSH预处理乌骨鸡皮肤黑色素细胞显著抑制α-MSH对黑色素细胞MC1R基因表达、cAMP含量、TYR活性和黑色素含量的上调作用(P0.05)。α-MSH能促进泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖,提高MC1R基因表达、cAMP含量以及TYR活性并进而促进黑色素合成。     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响.本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qR...