高效抑制O型口蹄疫病毒shRNA分子的筛选与验证

针对O型12蹄疫病毒（Foot—and—mouth disease veirus，FMDV）基因组高度保守的VP1和3D区段，选取了120个干扰靶位，根据RNAi技术原理，构建了包括对照在内的82个shRNA表达质粒；通过细胞攻毒试验，提取细胞毒液RNA，然后RT-PCR，最后real—time PCR检测病毒和shRNA的表达量。结果显示，干扰质粒组基因表达抑制率为63％～96．8％，其中pSiRe—Zs—VP1—54和pSiRe-Zs-3D-12等2个表达质粒抑制效率最好，分别为96．8％和87％，表明这2个表达质粒能够明显抑制FMDV的复制。     

以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组疫苗的构建

构建以多层纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒基因重组疫苗。在GenBank中查询编码O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1 141-160氨基酸和VP2 1-33氨基酸的核苷酸序列,合成该两段基因的重组基因并命名为VP1-VP2基因。再通过PCR扩增VP1和VP2基因,并将VP1、VP2及VP1-VP2基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1中,构建3种重组真核表达质粒(pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2),并分别对重组质粒进行酶切、PCR鉴定及测序分析。将构建的重组质粒制备成多层磷酸钙纳米颗粒,检测其粒径、稳定性及体外转染效率。重组质粒酶切结果显示,基因片段大小与预期相符;测序显示与GenBank中相应基因序列同源性为100%。制备的多层纳米颗粒粒径约为530nm;在4℃过夜保存后,溶液均匀透明;体外转染HEK293细胞的转染效率在9.6%左右。成功构建了以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组质粒,为进一步研究该基因疫苗奠定了基础。     

RNAi靶向GP5基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在MARC-145细胞中的复制

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JL/07/SW株GP5基因设计了3个RNA干扰靶位,构建shRNA表达质粒;将转染干扰质粒6 h后的MARC-145细胞接种病毒,并通过Real-time RT-PCR、TCID50、CPE、间接免疫荧光检测(IFA)对所设计的shRNA表达质粒的干扰效果进行评价;结果表明,构建的干扰质粒可以高效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制,说明GP5基因的这3个干扰靶位可能是PRRSV复制所必需的。本试验为PRRSV复制及基因组功能研究、抗病毒药物开发和转基因动物研究奠定了基础。     

质粒介导的siRNA对犬细小病毒复制的影响

RNA干扰(RNAi)是指短的双链RNA能降解与其互补mRNA,特异性诱发转录后基因沉默的现象,近年来成为抗病毒研究的新途径。为了探索siRNA对单链DNA病毒复制的影响,根据犬细小病毒(CPV)基因组序列选择4段21nt的保守序列设计4对SiRNA寡聚核苷酸,插入psiSTRIKE系列的U6发卡结构载体,构建了小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的psiSTRIKE表达载体,转染FK81细胞,筛选稳定的转染细胞,通过病毒感染检测、细胞活度测定和TCID50测定,研究质粒介导的siRNA对CPV复制的影响。结果表明,构建的4个psiSTRIKE表达载体转染细胞后,能够不同程度地抑制病毒在宿主细胞内的复制。因此质粒介导的shRNA能抑制CPV在细胞内的复制和感染,具有抗病毒作用,从而为进一步通过siRNA途径控制病毒奠定基础。     

小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

慢病毒介导siRNA抑制1型鸭肝炎病毒复制

为筛选能抑制DHAV-1复制的siRNA,探索RNAi技术在鸭病毒性肝炎防治中的应用,采用PCR法扩增DHAV-1 RdRp基因,并构建pEGFP-RdRp融合表达EGFP-RdRp蛋白;根据RdRp的序列测定结果,设计3条RdRp特异siRNA,并合成相应shRNA分别插入pmiRZipΔ中构建pRdRp-shRNA;共转染pRdRp-shRNA和pEGFP-RdRp于HEK-293T细胞,通过荧光显微镜法、流式细胞术、相对荧光定量PCR法筛选抑制效率较高的siRNA;将高效siRNA用于病毒载体pmiRZip介导的慢病毒制备;通过计算重组慢病毒转导、DHAV-1感染的鸭胚胎成纤维细胞中病毒TCID50和RdRp基因表达量确定siRNA对病毒及病毒基因的抑制作用。结果显示,3个siRNA均能抑制RdRp基因的表达,包含GDD模体的shRNA2的抑制率最高,对应重组病毒能使DHAV-1的TCID50下降6.2lg,RdRp基因转录量下降89.6%,抑制时间至少达120h,为鸭病毒性肝炎临床防治提供了新思路。     

慢病毒介导的RNAi靶向NDVP基因抑制其在CEF上的复制

通过研究慢病毒介导的RNA干扰靶向新城疫病毒P基因抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础。①针对NDVP基因设计siRNA干扰序列,构建慢病毒（lentivirus）介导的RNAi重组载体;②携带有siRNA表达元件重组慢病毒包装及其滴度测定;③包装后重组慢病毒接种CEF细胞并接毒NDV,48h分别进行Realtime RT-PCR和NDV滴度测定,并观察细胞病变情况。结果表明,本研究针对NDVNA-1株P基因2个RNAi靶位（位于开放阅读框的641和827位）设计的RNAi641和RNAi-827,对病毒复制具很强的抑制效果,且641位的重要性大于827位．     

短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

以新城疫病毒（NDV）NP基因为标靶，构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA（shRNA）的质粒载体，在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚上进行了RNAi试验，筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1。用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndvl转染CEF，以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照，4h后接种NDV，与对照相比，干涉组在病毒感染后3hNP基因的表达量降低2．3倍，     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

靶向VP1和VP2双拷贝shRNA重组表达质粒抑制传染性法氏囊病病毒复制的研究

为抑制传染性法氏囊病病毒(IBDV)的复制,本研究构建了靶向IBDV VP1和VP2基因的鸡双向U6启动子(chU6)双拷贝shRNA重组表达质粒pchU6-shRNA12,将其转染鸡胚成纤维细胞(CEF),再接种IBDV,72 h后,未出现细胞病变(CPE),病毒滴度小于101 TCID50/0.1mL;而转染空质粒和未转染两个对照组均出现明显的CPE,病毒滴度均达到108.75 TCID50/0.1 mL.此外,将pchU6-shRNA12与IBDV混合,接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔,96 h后,鸡胚发育正常,病毒滴度小于101 ELD5,0/0.1 mL,实时荧光定量RT-PCR检测VP1和VP2基因,比单纯接种IBDV组分别降低92％和95％;而含有空质粒和不含质粒两个对照组鸡胚则全部死亡,病毒滴度均达到107.00 ELD50/0.1mL.本研究结果表明,chU6启动子在双拷贝shRNA表达质粒pchU6-shRNA12中能高效驱动双拷贝shRNA的转录,生成的siRNA在CEF(in vitro)和鸡胚体内(in vivo)均能有效抑制IBDV的复制.     

RNA干扰技术抑制口蹄疫病毒复制研究进展

RNA干扰(RNAi)技术作为一种特异性地抑制哺乳类细胞外源性或内源性基因表达的方法,近年来在口蹄疫病毒(FMDV)防治研究中迅速发展起来。文章综述了利用RNAi技术抑制口蹄疫病毒复制的各种策略,包括化学合成或病毒载体转染构建抑制FMDV复制的小干扰RNA(siRNA)、构建多个FMDV功能区的SiRNA、交叉抑制不同血清型FMDV的siRNA的设计和双功能载体来双向防控FMDV的SiR-NA设计。RNAi干扰技术的发展,为设计防治口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

靶向传染性法氏囊病病毒VP1基因siRNA对病毒复制的抑制

根据传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP1基因保守区序列,选择设计了3个靶向VP1的小干扰RNA序列（siR-NA）：VP1-siRNA668、VP1-siRNA1034和VP1-siRNA2250,化学合成DNA序列,体外转录合成siRNA,转染鸡胚成纤维细胞（CEF）后接种IBDV,分析siRNA对病毒复制的影响。结果显示,病毒接种后72h,3个VP1-siRNA转染组未出现明显的细胞病变（CPE）,病毒滴度分别为102.75,102.00,101.75 TCID50/0.1mL,而siRNACON转染和单纯IBDV接种对照组均出现明显CPE,病毒滴度均为106 TCID50/0.1mL;用荧光定量RT-PCR分析VP1基因水平,3个VP1-siRNA转染组比对照组分别降低了73.10%,81.79%,90.28%。结果表明,本试验选择设计的3个siRNA具有明显抑制IBDV复制功能,其中2 250位点的siRNA抑制效果最明显,推测该区域是VP1基因的重要功能区,是新型抗IBDV药物与疫苗设计的重要靶标。     

绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒(pFastBacDual)的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜(EM)进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1～VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25～30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。     

利用RNAi抑制口蹄疫病毒的复制

根据口蹄疫病毒 IRES和 L 串联序列两侧的保守区域设计了 2个引物 ,利用 RT- PCR和 PCR方法扩增出该串联序列 ,并进行了测序。测序结果表明 ,扩增产物与 Gen Bank上相应的序列具有很高的序列同源性 (大于 99% )。在测序的基础上 ,选择了 L 基因上的 1个靶位点 (位于启始密码子下游第 2 2 9nt后 2 1 nt长的序列 ) ,合成了 si RNA表达盒SEC- L2 2 9。细胞单层长成 5 0 %～ 70 %时 ,将纯化的 SEC- L2 2 9转染到 BHK细胞中 ,转染 4 h后用高感染复数 FMDV接种 ,2 4 h后用间接免疫荧光方法对口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制进行检测。研究结果表明 ,SEC- L 2 2 9极大地抑制了口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制 ,且该抑制作用具有序列特异性 ,并降低了 BHK细胞的死亡率。另外 ,2 5 ng和5 0 ng SEC- L2 2 9处理组间对病毒复制的抑制作用差异不明显 ,可能是病毒基因组发生了突变。本试验表明 ,利用 PCR方法合成的 SEC在 BHK细胞中能特异性地抑制 FMDV的复制 ,RNAi技术可能为防治口蹄疫提供一个新的途径     

蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。     

蓝舌病病毒血清1型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型（BTV1）主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP）疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual 的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDual-BTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验（IFA）检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3 蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和 VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。