2014～2016年江苏省部分地区及监控点山羊的蓝舌病血清学调查

为了解蓝舌病病毒(BTV)在江苏省羊群中的感染和流行现状,采用C-ELISA试剂盒对2014~2016年采自江苏省9个市的419份羊血清进行了BTV抗体检测,共检出BTV抗体阳性样品30份,总阳性率为7.2%。在盱眙县桂五镇选择1个监控点,建立了BTV病原及抗体阴性山羊5头的监控动物群。从2014~2017上半年,每年5~10月每周采血1次,11月~次年4月每月采血1次,并采用BTV C-ELISA试剂盒进行BT血清学监测。结果发现:每年自8月开始,羊BTV抗体检测出现阳性结果,至12月,除2014年外监控羊群检测全为BTV抗体阳性。每年5~8月采用灯光诱捕法捕捉监测点蚊蠓,发现相较2015和2016年,2014年的蚊蠓捕捉数量明显偏少。对盱眙县地理位置和历年气候变化的分析结果表明:在库蠓活动高峰时期的持续低温阴雨天气,对BTV的感染可能有严重干扰。     

2014～2016年江苏省部分地区及监控点山羊的蓝舌病血清学调查

为了解蓝舌病病毒(BTV)在江苏省羊群中的感染和流行现状,采用C-ELISA试剂盒对2014²016年采自江苏省9个市的419份羊血清进行了BTV抗体检测,共检出BTV抗体阳性样品30份,总阳性率为7.2%。在盱眙县桂五镇选择1个监控点,建立了BTV病原及抗体阴性山羊5头的监控动物群。从20142016年采自江苏省9个市的419份羊血清进行了BTV抗体检测,共检出BTV抗体阳性样品30份,总阳性率为7.2%。在盱眙县桂五镇选择1个监控点,建立了BTV病原及抗体阴性山羊5头的监控动物群。从2014²017上半年,每年52017上半年,每年5¹0月每周采血1次,11月10月每周采血1次,11月^次年4月每月采血1次,并采用BTV C-ELISA试剂盒进行BT血清学监测。结果发现:每年自8月开始,羊BTV抗体检测出现阳性结果,至12月,除2014年外监控羊群检测全为BTV抗体阳性。每年5次年4月每月采血1次,并采用BTV C-ELISA试剂盒进行BT血清学监测。结果发现:每年自8月开始,羊BTV抗体检测出现阳性结果,至12月,除2014年外监控羊群检测全为BTV抗体阳性。每年5⁸月采用灯光诱捕法捕捉监测点蚊蠓,发现相较2015和2016年,2014年的蚊蠓捕捉数量明显偏少。对盱眙县地理位置和历年气候变化的分析结果表明:在库蠓活动高峰时期的持续低温阴雨天气,对BTV的感染可能有严重干扰。     

鹅源坦布苏病毒SHYG株的分离与鉴定

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。     

一株血清8a型禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

【目的】研究福建南平地区禽腺病毒(FAdV)血清8a型分离株的遗传演化情况及致病性,旨在为防控血清8a型FAdV感染提供参考。【方法】2022年8月,采集福建南平地区部分肉鸡养殖场出现的以包涵体肝炎为特征的肝脏病料,采用PCR技术检测FAdV核酸,将获得的阳性样品接种在无特定病原体(SPF)鸡胚上进行病原的分离纯化,利用hexon基因测序及序列分析等方法进行病毒鉴定,并在测定分离株毒力的基础上进行动物致病性试验。【结果】接种10 d后,鸡胚死亡,肝脏肿大、出血、坏死、呈土黄色;PCR鉴定和hexon基因序列分析表明,分离株与GenBank上的FAdV E型8a血清型澳大利亚TR59毒株的序列同源性高达99.5%,将该分离株命名为FJNP。FJNP株对1日龄SPF鸡的致死率为44%(11/25);剖检显示,感染鸡肝脏肿大、出血、边缘钝圆、呈土黄色、出现白色坏死点,脾脏和肾脏也出现肿大、出血等症状;肝脏组织病理学检查结果显示,感染鸡肝细胞大量变性坏死,肝细胞核可见嗜碱性包涵体及大量淋巴细胞浸润。实时荧光定量PCR检测显示,感染鸡体内多个组织器官均检测到病毒,且主要分布在肝脏,攻毒3、5、7...     

猪流行性腹泻病毒GD-A株的分离鉴定及S基因序列分析

【目的】在广东省某疑似发生猪流行性腹泻的猪场中,采集病猪的粪便样品,经RT-PCR检测阳性的样品接种于Vero细胞,以分离猪流行性腹泻病毒.【方法】通过在细胞上的连续传代,直至能稳定增殖.并通过RT-PCR对细胞培养物进行特异性片段的检测,观察细胞病变(CPE)的发生情况,以及间接免疫荧光(IFA)检测猪流行性腹泻病毒的M蛋白,对病毒进行分离与鉴定.【结果和结论】病毒在盲传5代时能观察到典型病变,传至20代时能在Vero细胞上增殖稳定.RT-PCR、CPE与IFA的结果证明,所分离到的病毒为PEDV,并命名为GD-A株.     

口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体的构建及VP1基因稳定表达细胞系的建立

【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。     

鸡肾型传染性支气管炎的初步诊断与治疗

【目的】研究河北秦皇岛地区的鸡肾型鸡传染性支气管炎（IB）流行病学、分离鉴定地方代表毒株,为有效防制当地鸡肾型IB及研制具有免疫针对性的疫苗制剂提供参考依据。【方法】通过流行病学调查、临床症状、病理变化观察,取新鲜病死雏鸡肝脏、肾脏组织悬浮液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔,收集鸡胚尿囊液,分别进行琼脂扩散试验、血细胞凝集（HA）试验和动物试验,并对症进行综合治疗。【结果】接种鸡胚出现典型的蜷缩、侏儒等病变,尿囊液琼脂扩散试验结果表现为阳性,经血清学试验及动物试验证实,该分离毒株为鸡传染性支气管炎病毒（IBV）,结合病理变化,确诊为鸡肾型IB。经对症治疗5d后,病鸡死亡率由1．0％下降至0．4％,鸡群呼吸道症状减轻,产蛋量回升,治愈率为92．4％。【结论】该起病例为鸡肾型IB,防制该病时应根据毒株性状针对性地选择用药及免疫接种。     

BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示：建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。     

脑心肌炎病毒VP1基因的克隆与原核表达

【目的】为获得重组脑心肌炎病毒VP1蛋白。【方法】利用RT-PCR方法对脑心肌炎病毒的VP1基因进行特异性扩增,并在pEASY-Blunt Zero载体中进行克隆。测序正确后,用Nde I和Hind III对重组质粒进行双酶切,将目的片段连接入原核表达载体pET-30a,提取质粒pET-30a-VP1,将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达和纯化。【结果】重组的结构蛋白VP1以包涵体的形式存在,纯化后获得的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在31.5kD处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-30a-VP1。【结论】以原核系统成功表达脑心肌炎病毒VP1蛋白,进一步为犬的脑心肌炎病毒的血清学检测奠定基础。     

中国蓝舌病病毒血清15型毒株的全基因组测序与进化分析

【目的】获取中国蓝舌病病毒血清15型(BTV-15)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。【方法】通过全长c DNA扩增与高通量测序技术获取中国1996年分离的BTV-15型毒株B105/YN/1996的全基因组序列,进行序列比对并构建系统发生树。【结果】序列分析结果显示:B105/YN/1996毒株基因组全长19 154 bp,各基因节段长度在822 bp (Seg-10)～3 944 bp (Seg-1)之间,编码蛋白大小在216 (NS3a蛋白)～1 302 (VP1蛋白)个氨基酸残基之间。B105/YN/1996毒株的Seg-1、-2、-3、-4、-6与澳大利亚2012年分离BTV-15型毒株的对应基因节段之间具有最近的亲缘关系,Seg-7、-8、-9、-10则与中国BTV-15型V447毒株、BTV-4型YTS4毒株和BTV-1型Y863毒株的序列相似度最高;Seg-5与印度BTV-1型毒株IND1992/02具有最近的亲缘关系。在构建的系统发生树上,B105/YN/1996毒株的Seg-2与Seg-6归属于东方型,Seg-3与Seg-4则构成独立远东型;Seg-7、-10分别构成独立东方-1与东方-2型。【结论】中国BTV-15型毒株B105/YN/1996的不同基因节段在遗传进化上呈现高度多样性的特点,提示该毒株为基因重配毒株;该毒株的Seg-3、-4、-7、-10形成了独特的地域型,提示中国BTV-15型毒株在进化上的特殊性。     

鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究

 【目的】探索鸡气管上皮细胞（chicken trachea epithelium,CTE）分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBV M41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细胞活性高,经过3步纯化后的CTE均一性高、生长快。两株IBV感染的CTE分别在接毒72和84 h后产生明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,血凝性和致鸡胚病变检测结果呈阳性。【结论】本研究成功分离培养了CTE,可以为CTE相关研究提供技术支持,并为IBV基础研究和应用奠定基础。     

2022—2023年我国部分地区猪A群轮状病毒分子流行病学调查分析

【目的】探究我国部分地区猪A群轮状病毒（RVA）的分子流行病学特征,明确当前的优势基因型,为RVA科学防控与疫苗研发提供理论依据。【方法】2022年1月—2023年3月收集江苏、江西、福建、山西和贵州5省36个规模化猪场送检的434份腹泻仔猪粪便样品,采用RT-PCR检测样品RVA阳性情况,对部分RVA阳性样品的VP7和VP4基因进行扩增及测序,与各型参考序列进行多序列比对,使用MegAlign进行核苷酸序列同源比对分析,并采用MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树。【结果】RT-PCR检测结果显示,434份腹泻仔猪粪便样品中RVA阳性样品为196份,阳性检出率为45.16%。2022年与2023年初的阳性检出率分别为40.37%(132/327)和59.81%(64/107)。根据样品来源地区,RVA阳性检出率最高的是江苏（57.70%）,其次是江西（55.71%）,福建、贵州和山西的RVA阳性检出率分别是35.66%、30.00%和22.23%。共获得各地区12株RVA的VP4和VP7基因序列信息,遗传进化分析结果表明,G型中G9为优势基因型（占83.4%）,G4和G5分别占8...     

逆转录病毒转染胚盘细胞制备嵌合体鸡胚的研究

 【目的】通过重组逆转录病毒体内感染源于第X期胚盘细胞的方法获得嵌合体鸡。【方法】将扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的开放阅读框插入逆转录病毒表达载体pour-pBabe中获得重组逆转录表达载体;采用磷酸钙转染法将其与包装载体pVSVG共转入293 10A1包装细胞中进行病毒包装,得到病毒原液经超速离心浓缩200倍后注入种蛋(第X期)胚盘下腔,孵化种蛋。提取孵化5.5天的鸡胚基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交检测。【结果】构建含EGFP完整开放阅读框的逆转录病毒表达载体pour-pBabe-EGFP,提取孵化5.5 d鸡胚基因组DNA,经PCR、Southern杂交检测,嵌合体阳性率分别为75%和66.7%。【结论】通过用重组逆转录病毒体内感染鸡胚盘细胞的方法可获得嵌合体鸡。     

流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用

以决定流行性出血病病毒(EHDV)血清型的第二基因节段(Seg-2)为检测靶基因,设计7对特异性引物,建立用于鉴定EHDV血清型的RT-PCR检测方法,并通过对扩增产物的测序,进一步了解病毒Seg-2的遗传特性。特异性试验结果显示,该检测方法可准确鉴定不同血清型的EHDV毒株,与蓝舌病病毒、中山病病毒、阿卡斑病毒均无交叉反应;灵敏度试验结果显示,对不同血清型EHDV核酸的检测下限均可达10~2拷贝;对我国不同时间与不同地域分离的EHDV毒株进行血清型RT-PCR鉴定,结果显示分离的31株EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10型等5种血清型,与血清中和试验的鉴定结果完全吻合。以上结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可快速准确地鉴定EHDV毒株的血清型。     

鸭出血性卵巢炎病毒血症研究

【目的】阐明鸭出血性卵巢炎病毒（DHOV-HB株）感染鸭后的病毒血症,为深入了解鸭出血性卵巢炎的发病机理、诊断和疫苗研究提供依据。【方法】24只250日龄北京鸭芯片标记后分别经口感染100倍稀释的DHOV-HB株（3×10⁴ELD₅₀）,并设空白对照组15只,同等条件下分别在隔离器内饲养,逐日观察10日,各组每日经翅静脉采集10只鸭血液（尽可能采集同一只鸭血液）,用于病毒分离和抗体测定。将攻毒后1-10 d的血清样本经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚,每份血清以0.1 mL/胚的剂量接种5枚SPF鸡胚,鸡胚接种后置于37℃条件下继续孵化,每日定时照胚2次,及时收获并统计24-168 h之内死亡的鸡胚,死亡鸡胚胚体经剪碎,研磨,离心后采用RT-PCR的方法检测病毒核酸,有1枚及1枚以上死亡鸡胚,且DHOV病毒核酸检测阳性,即将该鸭判为病毒分离阳性。同时采用中和试验测定攻毒后4-10 d的血清抗体,每个血清稀释度接种5枚SPF鸡胚。鸡胚接种途径及特异性死亡的判定方法同上。判定标准如下：血清原液保护80%（4/5）以上的鸡胚判为抗体阳性,保护20%-60%（1/5-3/5）的鸡胚判为抗体可疑,不保护鸡胚（0/5）判为抗体阴性。【结果】试验鸭感染DHOV后的病毒血症和免疫反应密切相关。感染后1-3 d,病毒血症出现并达到高峰,病毒分离均100%（10/10）阳性;4-6 d病毒分离率开始下降,分别为90%（9/10）、70%(7/10)和30%（3/10）阳性;7-10日血清中不再存在病毒,均为阴性(0/10)。中和试验结果表明攻毒后4 d,血清中病毒分离率下降的同时血清中即可能存在较低滴度的抗体,鸡胚死亡时间延后,此时抗体100%（10/10）阴性;攻毒后6 d的血清抗体80%（8/10）阴性,20%（2/10）可疑;攻毒后7 d 70%（7/10）阳性,10%（1/10）阴性,20%（2/10）可疑;攻毒后9 d 90%（9/10）阳性,10%（1/10）可疑;攻毒后10 d 100%（10/10）阳性。空白对照组血清病毒分离（1-10 d）和抗体检测（4-10 d）均为阴性。【结论】（1）DHOV口服感染成年鸭后,1-3 d日血清病毒分离率最高,感染后4 d 病毒分离率开始下降,感染后7 d血清病毒分离阴性。感染后7 d抗体70%（7/10）阳性,感染后10 d 100%（10/10）阳性;（2）病毒血症的持续时间与特异性免疫应答密切相关。     

蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究

 为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-ELISA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.（双侧）=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD 公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。     

禽流感流行病学调查及病原分离鉴定初报

采用病毒分离鉴定和血清学鉴测等方法 ,对不同地区 5群自然发病鸡进行流行病学调查、临床症状观察和病理解剖学及组织学检查 ,同时采集病料感染鸡胚和传代。每代鸡胚尿囊液用血清学检测效价滴度。结果 :共分离出 5件病毒 ,其中 4株感染和盲传鸡胚均能致死鸡胚 ,传代后能引起鸡胚肾单层细胞病变 ,HA价在 1∶ 40以上 ,DN和 EDS-76(A3除外 ) H1试验均为阴性 ,AGP试验阳性 ,证明为 AIV;另 1株则为NDV。     

乌鸡传染性法氏囊病毒的分离鉴定与分子生物学特性研究

从一群精神不振、拉白色稀粪便为特征的乌鸡中分离到 1株病毒。经血清学试验、鸡胚接种试验、动物回归试验等鉴定为法氏囊病毒。该病毒与鸡法氏囊病毒的血清型无明显差异。根据IBDV的VP2基因序列设计了一对特异性引物 ,应用RT -PCR法从中扩增出了一条0 .72kb的VP2基因高变区片段。序列分析表明 ,片段长 0 .72kb ,编码 2 4 0个氨基酸 ,与其他毒株的VP2基因序列比较分析 ,该毒株符合IBDV超强毒的特征。虽然有 4处氨基酸发生了变化 ,但没有引起其抗原性的改变     

IBDV细胞适应株的驯化及其VP2基因的分子特征分析

【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50);通过SPF鸡胚-CEF-DF-1途径对X1进行驯化,使其适应永生细胞DF-1;根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV分离株和细胞适应株的VP2基因并测序,将其与参考毒株进行同源性和进化树分析,同时对二者在VP2高变区及七肽区的推导氨基酸序列进行对比分析。【结果】IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的ELD_(50)为10-8 mL~(-1),经驯化获得了细胞适应株C1。对2株病毒的VP2基因进行克隆并鉴定,测序分析得IBDV X1株在第222,256,294和299位上具有A、I、I、S4个特征性氨基酸,与IBDV超强毒株(vvIBDV)HK46 VP2基因氨基酸序列的同源性高达99.3%,确定X1株为IBDV超强毒株。同源性及进化树分析结果显示,C1株与IBDV减毒株CEF94亲缘关系较近,同源性较高,为99.6%,确定C1株为IBDV减毒株。在VP2高变区及七肽区推导氨基酸比对中显示,C1株第330位精氨酸R取代了X1株在330位的丝氨酸S;第222位氨基酸由A变成P;决定病毒毒力的位点第256和284位分别由I、A变为V和T。【结论】成功驯化了1株vvIBDV使其适应细胞,初步揭示vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化的过程中,VP2高变区及七肽区氨基酸序列有明显变化。