猪NR1H3基因可变剪接体的克隆及表达特性研究

旨在克隆猪NR1H3基因的可变剪接体,并预测编码蛋白的结构与功能,研究其转录本的表达特性。本试验以马身猪为研究对象,采用RT-PCR及克隆测序技术对猪NR1H3基因CDS区进行扩增和克隆,采用生物信息学方法分析NR1H3蛋白的生物学特性,采用qRT-PCR技术检测NR1H3基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、股二头肌、腰大肌和皮下脂肪组织中的表达谱及在脂肪组织中的发育性表达规律。结果表明,本研究成功克隆出猪NR1H3基因的两个转录本NR1H3-1和NR1H3-2,其中NR1H3-2为新发现的转录本(MN082630),其CDS区全长1 203bp,编码的蛋白质含400个氨基酸,属于中性不稳定蛋白;与NR1H3-1相比,NR1H3-2缺失了长度为95bp的第9外显子,编码的蛋白质NR1H3-2比NR1H3-1少了一个肝X受体的配体结合结构域;氨基酸的相似性分析发现,猪NR1H3蛋白氨基酸序列与北大西洋小须鲸、山羊、绵羊、抹香鲸、长江江豚等物种的相似性较高。NR1H3-1和NR1H3-2在所检测组织中均有表达,且在不同组织间的表达量具有显著差异(P0.05);NR1H3-1转录本在小肠中表达量最高,其次是脾、肝、股二头肌等,在心脏中表达量最低;NR1H3-2则在肝中表达量最高,其次是脾、小肠、胃和股二头肌等,在心脏中表达量最低。在各组织中(除小肠、心、肺),NR1H3-2的表达量均高于NR1H3-1,其中在肝和皮下脂肪组织中,NR1H3-2的表达量极显著高于NR1H3-1(P0.01),在胃中差异达显著水平(P0.05)。随着日龄的增加,皮下脂肪组织中NR1H3-1和NR1H3-2的表达量整体呈上升趋势,推测该基因对猪的脂肪沉积有调控作用。本试验成功克隆了猪NR1H3基因的两个可变剪接体,并推测其对猪脂质代谢及脂肪生成具有重要的生理作用。     

猪NR1H3基因可变剪接体的克隆及表达特性研究

旨在克隆猪NR1H3基因的可变剪接体,并预测编码蛋白的结构与功能,研究其转录本的表达特性。本试验以马身猪为研究对象,采用RT-PCR及克隆测序技术对猪NR1H3基因CDS区进行扩增和克隆,采用生物信息学方法分析NR1H3蛋白的生物学特性,采用qRT-PCR技术检测NR1H3基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、股二头肌、腰大肌和皮下脂肪组织中的表达谱及在脂肪组织中的发育性表达规律。结果表明,本研究成功克隆出猪NR1H3基因的两个转录本NR1H3-1和NR1H3-2,其中NR1H3-2为新发现的转录本（MN082630）,其CDS区全长1 203 bp,编码的蛋白质含400个氨基酸,属于中性不稳定蛋白;与NR1H3-1相比,NR1H3-2缺失了长度为95 bp的第9外显子,编码的蛋白质NR1H3-2比NR1H3-1少了一个肝X受体的配体结合结构域;氨基酸的相似性分析发现,猪NR1H3蛋白氨基酸序列与北大西洋小须鲸、山羊、绵羊、抹香鲸、长江江豚等物种的相似性较高。NR1H3-1和NR1H3-2在所检测组织中均有表达,且在不同组织间的表达量具有显著差异（P<0.05）;NR1H3-1转录本在小肠中表达量最高,其次是脾、肝、股二头肌等,在心脏中表达量最低;NR1H3-2则在肝中表达量最高,其次是脾、小肠、胃和股二头肌等,在心脏中表达量最低。在各组织中（除小肠、心、肺）,NR1H3-2的表达量均高于NR1H3-1,其中在肝和皮下脂肪组织中,NR1H3-2的表达量极显著高于NR1H3-1（P<0.01）,在胃中差异达显著水平（P<0.05）。随着日龄的增加,皮下脂肪组织中NR1H3-1和NR1H3-2的表达量整体呈上升趋势,推测该基因对猪的脂肪沉积有调控作用。本试验成功克隆了猪NR1H3基因的两个可变剪接体,并推测其对猪脂质代谢及脂肪生成具有重要的生理作用。     

猪CPB2基因可变剪接体的克隆及生物信息学研究

本研究旨在克隆猪CPB2基因的不同可变剪接体,预测对应蛋白的功能特性以及研究不同转录本表达特性。以健康状态和体重相同的3头12月龄巴马小型猪为试验动物,通过RT-PCR技术及基因平末端克隆技术扩增猪CPB2基因的CDS区及部分非编码区,利用生物信息学工具预测CPB2编码蛋白的基本生物学特征,利用RT-PCR技术检测CPB2基因在肝、心、肾、皮下脂肪、肠系膜脂肪、股二头肌和背最长肌中的表达特征。以实验室制备的代谢性疾病易感猪为试验动物,利用qRT-PCR技术检测CPB2基因在富营养饮食效应下肝中的表达特征。结果表明,本研究成功克隆出猪CPB2基因的3种可变剪接体（CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3）,其中CPB2-1与NCBI序列XM_001929146.4相同,CPB2-2和CPB2-3为新发现转录本。与CPB2-1相比,CPB2-2和CPB2-3发生了5'端可变剪接（alternative 5'splice site,A5SS）事件;CPB2-1编码423个氨基酸的酸性不稳定性蛋白,CPB2-2和CPB2-3编码同种281个氨基酸的碱性不稳定性蛋白;与CPB2-1相比,CPB2-2和CPB2-3缺少信号肽和激活肽,但具有相同羧肽酶活性结构域;CPB2基因3种转录本仅在肝和肾中表达,其他组织无表达;在富营养饮食诱导的代谢性疾病易感猪的肝中,CPB2-1（P<0.01）和CPB2-2（P<0.01）显著降低,CPB2-3未显著降低（P=0.14）。综上,本研究成功在肝中克隆了猪CPB2的3种可变剪接体,推测CPB2-1是行使纤溶与凝血等生理功能的正常转录本;新发现转录本CPB2-2和CPB2-3被留在肝和肾中可能具有羧肽酶活性和重要生理学功能;CPB2基因可能与代谢相关的慢性肝病存在一定联系。     

猪TLR4基因可变剪接体的鉴定

为合理、有效地利用民猪资源进行抗病育种,本研究利用重叠延伸RT-PCR结合巢式PCR法扩增民猪TLR4基因,寻找可变剪接体;利用竞争性RT-PCR方法研究各可变剪接体的组织表达情况。获得了猪TLR4基因3个可变剪接体(其中2个是未见报道的),并且鉴定出一类特殊的剪接模式——外显子内部的部分片段被单独剪除,该类型在动物中尚属首次发现;组织表达分析表明3个可变剪接体普遍表达。TLR4基因存在着复杂的剪接机制,也暗示着其功能的复杂性。     

马身猪MEF2A基因4种可变剪接体的克隆和生物信息学分析

本研究旨在克隆马身猪肌细胞增强因子2A（myocyte enhancer factor 2A,MEF2A）基因的不同剪接体类型。依据转录组测序对可变剪接的预测结果,试验扩增MEF2A基因第5~8外显子之间的编码区,用生物信息学软件分析了马身猪MEF2A基因不同剪接体的序列特性,预测保守结构域,构建系统进化树,比对不同物种MEF2A的氨基酸同源性。结果显示,获得了4个MEF2A基因的剪接体,MEF2A1的第5~8外显子正常剪接;MEF2A2缺失了第5外显子,第6外显子的5'端多出138 bp,第7外显子的3'端多出102 bp;MEF2A3缺失了第5外显子,第6外显子的5'端多出138 bp;MEF2A4第7外显子的3'端多出102 bp。插入的138 bp序列编码的蛋白质中存在1个保守结构域HJURP_C,这可能与MEF2A参与肝细胞纤维化作用有关。MEF2A1和MEF2A4与猪MEF2A1（GenBank登录号:NP_001090890.1）同属于一个亚群,同源性高达98.9%,MEF2A2和MEF2A3与猪MEF2A2（GenBank登录号:NP_001093168.1）同属于一个亚群,同源性分别为98.2%和98.9%。本试验成功克隆了4个MEF2A基因的剪接体,为进一步研究其蛋白功能奠定基础。     

MYNN基因在猪不同组织及肌肉中的表达规律

试验旨在研究myoneurin（MYNN）基因在猪不同组织中的表达特征及其在肌肉（背最长肌、股二头肌和腰大肌）、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR技术研究猪MYNN mRNA在90日龄大白猪和马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小脑、小肠、胰脏、胃、股二头肌及脂肪共11个组织中的表达谱,以及在大白猪和马身猪1、90、180日龄3个发育阶段的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。结果表明,MYNN在猪的各种组织中广泛表达,且各组织间表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）;MYNN在大白猪和马身猪的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的不同发育阶段表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）,并具有特定规律,由此推测其可能在猪的这几种组织中发挥重要作用。MYNN基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关。本试验为研究猪MYNN基因的生物学功能提供了依据,但还需要深入的研究来探索其作用的具体机制,尤其是在骨骼肌发育中的调节机制。     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

山羊INSR基因可变剪接体在背最长肌中的表达模式

旨在对山羊胰岛素受体(insulin receptor,INSR)基因进行可变剪接分析,研究其在背最长肌中的表达模式。本试验以简州大耳羊妊娠期胎儿(妊娠期第45、60和105天)及出生后第3天羔羊背最长肌为试验材料,基于转录组测序数据(accession number:SRR3567144)并利用Sanger测序验证,分析INSR基因的可变剪接体类型及其在背最长肌中的表达差异,同时利用在线软件对不同可变剪接体进行生物信息学分析。结果显示,在山羊背最长肌中INSR基因CDS区存在4种不同的可变剪接形式(INSR1、INSR2、INSR3和INSR4),其CDS长分别为4 110、4 146、 4 113和4 149 bp,对应的氨基酸残基数分别为1 369、1 381、1 370和1 382个。山羊INSR 4个可变剪接体之间的主要区别在于Exon 11(36 bp)跳跃和Exon 15部分(3 bp)缺失,这两种可变剪接模式在牛、猪、山羊、人、绵羊和小鼠间完全一致。这些可变剪接改变了山羊INSR的Ser磷酸化位点和第二个FN3功能域,使所编码蛋白3D结构在两个区域发生明显改变。同时,各可变剪接体表达量在背最长肌发育的4个时期均无显著性差异(P0.05),同一时期各可变剪接体表达量之间也无显著性差异(P0.05)。INSR基因序列和剪接模式在哺乳动物中高度保守,该研究结果将为深入揭示INSR基因对动物肌肉发育的调控机制提供理论参考。     

山羊INSR基因可变剪接体在背最长肌中的表达模式

旨在对山羊胰岛素受体（insulin receptor,INSR）基因进行可变剪接分析,研究其在背最长肌中的表达模式。本试验以简州大耳羊妊娠期胎儿（妊娠期第45、60和105天）及出生后第3天羔羊背最长肌为试验材料,基于转录组测序数据（accession number：SRR3567144）并利用Sanger测序验证,分析INSR基因的可变剪接体类型及其在背最长肌中的表达差异,同时利用在线软件对不同可变剪接体进行生物信息学分析。结果显示,在山羊背最长肌中INSR基因CDS区存在4种不同的可变剪接形式（INSR1、INSR2、INSR3和INSR4）,其CDS长分别为4 110、4 146、4 113和4 149 bp,对应的氨基酸残基数分别为1 369、1 381、1 370和1 382个。山羊INSR 4个可变剪接体之间的主要区别在于Exon 11（36 bp）跳跃和Exon 15部分（3 bp）缺失,这两种可变剪接模式在牛、猪、山羊、人、绵羊和小鼠间完全一致。这些可变剪接改变了山羊INSR的Ser磷酸化位点和第二个FN3功能域,使所编码蛋白3D结构在两个区域发生明显改变。同时,各可变剪接体表达量在背最长肌发育的4个时期均无显著性差异（P>0.05）,同一时期各可变剪接体表达量之间也无显著性差异（P>0.05）。INSR基因序列和剪接模式在哺乳动物中高度保守,该研究结果将为深入揭示INSR基因对动物肌肉发育的调控机制提供理论参考。     

猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。     

猪GPS2基因的克隆及表达分析

G蛋白途径抑制因子2(G-protein pathway suppressor,GPS2)是近年来新发现的肿瘤抑制因子,是一种多功能蛋白质,参与了多个细胞的进程,能够抑制酵母中由于G-蛋白信号通路持续激活引起的死亡。目前,GPS2基因的研究领域主要分布在人、小鼠等。在人的领域,有最新研究表明GPS2基因调控细胞核中的基因表达。这项研究发现GPS2在细胞膜水平上负调控肿瘤坏死因子-α激活(TNF-α)的信号级联反应中起着至关重要的作用。他们发现增加GPS2的水平会损害细胞对TNF-α的反应,降低炎症反应。鉴于此信息,研究人员分析假如脂肪组织中有更多GPS2的话,是否有助于降低肥胖患者胰岛素抵抗的发展。结果发现,脂肪组织中的胰岛素信号被大大改善。然而在核中过表达的GPS2对肝功能也有负面影响。另外其研究表明GPS2在减轻炎症反应中起着重要的调节功能。这些研究结果揭示了一个针对2型糖尿病和代谢综合征等疾病治疗的潜在的新方向。本实验则是基于实验室前期全基因组关联分析(GWAS)工作,筛选出GPS2基因,针对目前GPS2基因的研究成果,考虑到该基因可能与猪的脂肪沉积有所关联,因而进行初步的基因克隆和序列分析,并研究其在长白猪种的不同组织表达情况差异,从而确定该基因是否对猪的脂肪沉积有确定的规律性影响,为后期的深入工作做探索。     

猪Mx1基因的克隆表达及抗病毒活性研究

本文应用(RT-PCR)技术,从猪瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7 h的PK15细胞的cDNA中扩增出编码Mx1蛋白的全长基因,并通过引物设计填补了PK(15)细胞系Mx1 cDNA序列中3’端11bp的缺失,成功获得Mx1完整基因的克隆。构建了重组表达质粒pRetroQ-sMx1,转染HEK293T细胞并表达Mx1蛋白,利用微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性。双酶切鉴定和核酸序列测定证实pRetroQ-sMx1真核表达质粒构建成功,转染HEK 293T细胞后,能够检测到绿色荧光,Western blot证实为目的蛋白。微量细胞病变抑制法测定重组蛋白具有一定的抗水疱性口炎病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。重组Mx1具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组Mx1蛋白的活性以及Mx1抗病毒药物奠定了基础。     

猪SLA-DRB基因的克隆及在大肠杆菌的表达

试验旨在通过基因工程方法获得重组猪SLA-DRB蛋白。根据基因库猪SLA-DRB基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基;提取长白猪肠系淋巴结RNA,用RT-PCR的方法扩增猪SLA-DRB基因cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a-DRB;将重组表达质粒转化至宿主菌Rosseta中,诱导表达。结果表明,成功扩增出猪SLA-DRB基因cD-NA,经DNA序列测定,所得基因与国外报道的序列99.9%相同;成功构建原核表达载体pET-32a-DRB;经IPTG诱导,表达出了6×His-DRB融合蛋白,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,得到了约50kDa左右蛋白,与预期大小相符,表明猪SLA-DRB基因在大肠杆菌中成功的进行了表达。     

猪HMGR基因组织表达特性研究

为了解猪HMGR基因的组织表达特点和规律,本研究通过RT-PCR半定量和Real-timePCR方法,检测猪HMGR基因在各组织中的表达。结果表明:猪HMGR基因在检测的15种组织中均表达,在各组织中的相对表达量高低依次为肝脏>心脏>肾脏>膀胱>皮下脂肪>肺脏>子宫>大肠>大脑>脾脏>脊髓>胃>卵巢>背最长肌>小肠。HMGR在肝脏中最高表达,为"肝脏是胆固醇合成的主要场所"这一观点提供了佐证。此外,HMGR在心脏、肾脏和膀胱中也有较高水平表达,说明该酶也在这些组织中起重要作用,但作用机理需进一步加以验证。     

猪MyD88基因的克隆及组织表达谱分析

本研究旨在克隆猪MyD88的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异.利用RT-PCR技术从猪肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪MyD88的cDNA序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用Real-time PCR技术对MyD88基因的组织表达谱进行了分析.序列分析结果表明克隆到的序列全长为897 bp(EF198416),其882 bp的开放阅读框编码的293个氨基酸残基组成猪髓样分化因子88(MyD88);推导的氨基酸序列分析显示:猪MyD88蛋白具有典型的死亡结构域和TIR结构域,相似性分析结果显示,MyD88在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、褐鼠和小鼠的氨基酸序列相似性分别为88.4%、85.7%、78.8%和78.2%;Real-time PCR结果表明:MyD88在11个组织中的相对表达水平存在差异,其在派伊氏小体和肠系膜淋巴结中表达量相对较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.猪MyD88基因的克隆和表达研究为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

猪C1QTNF3基因可变剪接体的鉴定及介导miR-101调控成脂分化的研究

旨在研究猪C1QTNF3基因可变剪接体的特性及miR-101通过C1QTNF3基因促进猪脂肪SV细胞成脂分化的机制。本研究采集3头30日龄健康马身猪仔公猪心、肝、脾、肺、肾、胃、股二头肌、腰大肌、皮下脂肪和背部脂肪组织样品,首先利用RT-PCR技术和生物信息学方法对C1QTNF3基因的不同转录本进行扩增和生物学特性分析,采用qRT-PCR技术检测C1QTNF3基因不同转录本在猪组织中的表达变化。随后,利用生物信息学预测发现,C1QTNF3上游的调控因子是miR-101,采用双荧光素酶报告试验验证miR-101对C1QTNF3的调控作用。最后,利用油红O染色和qRT-PCR技术检测过表达miR-101对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响。基因克隆得到猪C1QTNF3存在两个转录本C1QTNF3和C1QTNF3-1,其中C1QTNF3-1为新鉴定的转录本;测序分析显示,与C1QTNF3相比,C1QTNF3-1的第1外显子区域缺失了219个碱基,少编码73个氨基酸。进化树分析显示,猪C1QTNF3和C1QTNF3-1蛋白序列与人和马来亚穿山甲等物种的亲缘关系较近。C1QTNF3和C1QTNF3-1在猪各组织中均有表达,且在各组织中C1QTNF3-1的表达量均极显著高于C1QTNF3（P<0.01）。过表达miR-101极显著下调C1QTNF3 3'UTR区域的荧光素酶活性（P<0.01）和C1QTNF3 mRNA的表达（P<0.01）,同时增加了脂肪细胞成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPβ、SREBP-1c和FABP4的mRNA表达量（P<0.01）。本试验成功克隆了猪C1QTNF3基因的两个可变剪接体,其中C1QTNF3-1在猪不同组织中均高表达,推测该转录本为基因发挥功能的主要亚型。并深入研究了C1QTNF3基因的上游调控因子,揭示了miR-101靶向C1QTNF3促进成脂分化的机制,丰富了C1QTNF3的生物学作用和调控网络。     

猪泛素-B 基因的克隆及组织表达谱分析

从人泛素-B（Ubiquitin B,UbB）基因mRNA序列出发,在猪的ESTs库中进行同源性搜索,通过电子克隆和进一步RT-PCR方法从猪肌肉组织总RNA中扩增出泛素-B基因部分cDNA序列（GenBank登录号：EF688558）,长894bp,其中在89～778bp处包含一个完整的开放阅读框,编码229个氨基酸。猪泛素-B基因由2个外显子和1个内含子构成（GenBank登录号：EF688559）,内含子长657bp,符合GT-AG规则。序列分析结果表明：猪泛素-B基因与已报道的人、黑猩猩、小家鼠、大鼠、鸡等物种的泛素-B基因高度同源,同源性分别为92％、91％、91％、91％、89％,氨基酸序列同源性为100％。半定量RT-PCR结果表明：泛素-B基因在150日龄肥育猪心脏、肝脏、肾脏、小脑中的表达量较高,脾脏、肺脏、胃、膀胱、背最长肌、大脑次之,脂肪和下丘脑中的表达量最低,其在蓝塘与长白猪肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、膀胱、背最长肌等7个组织中的表达量存在差异。     

猪JHDM2A基因的克隆及表达分析

试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。     

猪PD-1胞外区基因的克隆及原核表达

为研究PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制性疾病中的作用,根据猪的PD-1的基因序列,设计扩增其胞外区的引物,从猪PBMC基因组中通过PCR扩增获得猪PD-1胞外区基因片段,测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET32-PD1,转化大肠埃希菌DH5α。挑选可疑菌落鉴定正确后转至Rosetta(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,在37℃、0.5mmol/L IPTG条件下诱导获得33ku的PD-1胞外区融合蛋白,能够被其多抗血清、His标签抗体和人PD-1抗体所识别。本研究为制备其单克隆抗体和研究PD-1/PD-L1在猪免疫抑制性疾病中的作用提供了材料。