变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)S和N融合双基因质粒的构建及鉴定

为构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和N融合双基因质粒并表达出相应的蛋白,通过扩增变异PEDV的S和N基因,将S基因连接到pEAS-Blunt M2(M2)真核表达载体,构建M2-S质粒,通过同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至M2-S基因片段,再转化到Trans1-T1感受态细胞中,构建M2-S-N融合双基因质粒。将M2-S-N融合双基因质粒转染到293T细胞,可表达出相应的S-N融合双基因蛋白。利用RT-PCR、Western blot技术和免疫BLAB/c鼠试验鉴定载体及蛋白表达的免疫活性,结果成功构建了M2-S-N融合双基因质粒,并表达出具有免疫原性的S-N融合双基因蛋白,且该蛋白能够诱导小鼠产生特异性抗体。变异PEDV的S和N基因融合双基因质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术及基因工程疫苗等研究奠定良好基础。     

猪流行性腹泻病毒变异株M和N双基因的融合表达及免疫原性分析

为了获得具有良好免疫原性的猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株M和N双基因融合蛋白,本研究采用RT-PCR方法分别扩增PEDV变异毒株M、N基因,利用限制性内切酶依次将其定向克隆至pMD18-T载体,将串联的N和M融合基因片段亚克隆至pGEX-KG原核表达载体,构建pGEX-NM双基因重组质粒,转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得了以包涵体表达的N-M双基因融合蛋白,融合蛋白经Western blot检测能够被兔抗PEDV阳性血清识别,将融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,经间接ELISA检测其抗体效价高达1∶12 800以上。本研究获得了具有良好免疫原性的N-M双基因融合蛋白,为M和N蛋白抗原表位鉴定以及结构与功能研究、PEDV变异机制与免疫机制研究、PED新型疫苗和诊断试剂研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白在杆状病毒中的表达及免疫原性分析

为了研制一种有效控制猪流行性腹泻的疫苗,本试验设计了两对引物,分别扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要抗原表位S1(S蛋白中一个有效的抗原位点)和M蛋白的基因。将两段基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中,构建了重组转移质粒pFBD-S1-M,并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M,转染Sf9昆虫细胞后,拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M。表达产物经过SDS-PAGE和Western blot检测,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,表明共表达的蛋白具有良好的反应原性。本研究为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSV HB-3株GP5、M和N基因,通过Linker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因一起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体(1∶4),随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高(1∶32)。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础.     

H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSVHB-3株GP5、M和N基因,通过I,inker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因-起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-MN免疫Balb／c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体（1：4）,随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高（1：32）。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。     

牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株E2基因的克隆表达及免疫原性分析

为了研究牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的免疫原性,试验采用PCR技术扩增牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株去除跨膜区的E2基因,将获得的s E2基因克隆到p ET20b载体构建重组质粒p ET20bs E2,并转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞及诱导表达,应用SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA对表达产物进行分析,取纯化的表达产物加等量佐剂免疫家兔,观察免疫效果。结果表明:s E2基因得到了高效表达,表达的重组蛋白分子质量约为37.0 ku,表达产物能诱导免疫家兔产生高效价抗BVDV抗体。说明表达产物s E2蛋白具有良好的免疫原性。     

牛分枝杆菌Mb1761C蛋白的表达及其免疫原性初步研究

根据GenBank提供的M.bovis Mb1761c基因序列设计引物。以牛分枝杆菌DNA为模板,通过PCR方法扩增出牛分枝杆菌MB1761c基因片段,以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物和pET28a（＋）后将纯化的Mb1761c基因克隆至pET28a（＋）中,构建出原核表达质粒,再转化到E．coli BL21（DE3）表达菌株中,IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE,分析可见约29ku特异性蛋白条带,Western blot分析发现,该融合蛋白具有较强的免疫原性,从而为进一步研究其亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。     

基于间接ELISA检测方法新生仔猪流行性腹泻病探析

本文为探析新生猪仔的流行性腹泻病毒,构建猪流行性腹泻病毒蛋白间接的ELISA检测方法,从新分离PEDV流行毒株中扩增其N基因,并将N基因克隆至DNA原核表达载体中构建重组质粒,经过诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立ELISA检测方法,并且对各种检测条件进行优化优化后确定N蛋白最佳包被条件为37度,该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了有益参考。     

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）N蛋白,通过PCR扩增获得PEDV的N基因片段与载体pET-32a（+）相连构建原核表达载体pET-32a（+）-PEDV-N。将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG（1 mmol/mL）37℃诱导表达后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,对影响重组蛋白表达的诱导时间进行分析。利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性。结果表明：PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N测序正确,含有重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N的表达菌株BL21（DE3）在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,利用Western blot结果表明该重组蛋白与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PEDV-N重组蛋白。     

破伤风毒素C片段基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与新城疫病毒F蛋白的融合表达及免疫原性分析

应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆到质粒pET30a+上,获得重组原核表达质粒pET-fliC-F,将其转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。Western blot证实重组菌表达的fliC-F融合蛋白能与小鼠抗fliC和抗F蛋白两种多抗血清发生特异性反应。动物试验显示,fliC-F融合蛋白能够刺激C3H/HeJ小鼠产生针对F蛋白的特异性血清抗体,说明原核表达系统表达的fliC-F融合蛋白具有较好的免疫原性。     

鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析

根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）微线蛋白5（Micronemeprotein5,MIC-5）基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫（E．necatrix）DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1470bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a（＋）载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57．5ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E．necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

猪流行性腹泻病毒S基因与SEA基因融合表达及免疫原性评价

试验旨在构建pET-28a-S-SEA融合表达质粒,并评价S-SEA蛋白的免疫原性。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,对我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株(GenBank:LT906620.1)的S基因与金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因(GenBank:MH053151.1)进行优化,通过柔性连接肽(GGGGS)连接后,克隆至表达载体pET-28a,得到pET-28a-S-SEA重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测后,对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,将亲和层析后的重组蛋白,免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,对免疫小鼠的血清特异性抗体水平和淋巴细胞增殖指数进行检测。结果成功构建pET-28a-S-SEA质粒,且在大肠杆菌中获得高效表达;小鼠试验结果表明,纯化的S-SEA蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,促进淋巴细胞增殖,具有良好的免疫原性,为进一步研究猪流行性腹泻亚单位疫苗提供帮助。