猪口蹄疫免疫疫苗及使用

猪口蹄疫免疫疫苗包括口蹄疫O型灭活疫苗、口蹄疫O型合成肽疫苗。一般在免疫21d后,进行免疫效果监测：（1）亚洲Ⅰ型口蹄疫：液相阻断ELISA;（2）O型口蹄疫：正向间接血凝试验、液相阻断ELISA或VP1结构蛋白抗体ELISH。     

四川省2017年口蹄疫免疫抗体的集中监测及分析

研究于2017年春、秋季集中免疫后,在四川省21个市(州)随机抽取一个县(区)分别采集规模场、散养户和屠宰场的猪、牛、羊血清,共计4 707份,对口蹄疫三个型(O型、A型、Asia 1型)均采用ELISA方法进行免疫抗体检测。结果显示,四川省O型口蹄疫免疫抗体平均合格率为90.4%,其中猪血清合格率为93.0%,牛、羊血清的合格率为85.2%;Asia 1型口蹄疫抗体合格率为89.7%;A型口蹄疫合格率为92.6%。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。     

达州县级兽医实验室检测能力比对结果分析

为检验和提升达州市兽医实验室检测能力,达州市动物疫病预防控制中心组织全市7个县级兽医实验室开展了H5亚型禽流感抗体(HA-HI)、O型口蹄疫抗体(ELISA)和非洲猪瘟病毒核酸(RT-PCR)三项检测试验能力比对。结果显示:H5-AI Ab、O-FMD Ab和ASFV核酸检测符合率分别为94.29%、94.29%、88.57%。结果表明,县级兽医实验室HI和ELISA方法掌握较好,而RT-PCR检测病毒核酸的技术有待提高。     

IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

试验建立了IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法,并进行了验证。经试验研究,封闭液用1.5%Casein酪蛋白、包被液用0.02M的PB溶液、包被浓度为1/1 000,酶标单抗浓度为1/1 000,酶稀释液为小反刍酶稀时,该IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的灵敏度和稳定性最佳,此时的板内变异系数为7.7%,板间变异系数为9.41%,均低于10%,且热稳定性良好。试验建立的竞争ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏度,可用于IBR病毒抗体的检测。     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。     

牙鲆淋巴囊肿病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以牙鲆淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的兔抗LCDV血清为检测抗体,建立了LCDV病毒双抗夹心间接ELISA检测方法.该方法最佳反应条件为:单克隆抗体包被质量浓度为2 μg/ml,兔抗血清工作浓度为1∶1200稀释,以3%牛血清白蛋白作为封闭液.应用本方法对体表具有明显发病症状的牙鲆、与发病鱼同池但体表无症状的牙鲆及健康牙鲆的肝、脾、肾、胃、肠、心脏、鳃等7种组织进行检测,在前两种鱼的胃、肠、鳃等组织检测到病毒,而健康牙鲆各组织器官反应结果均为阴性,试验结果表明,所建立的ELISA检测方法具有特异性强、可靠性高的特点,可用于养殖牙鲆LCDV的检测.     

施氏鲟肿嘴病快速检测方法的研究

以施氏鲟(Acipenser schrenckii)肿嘴病病原菌异常嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测施氏鲟肿嘴病病原菌的ELISA技术。结果显示:采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别是为107CFU和1∶100000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应均呈阴性;阻断试验中的阻断率达67.3%;交叉反应和阻断试验的结果表明该方法具有较高的特异性。将此方法标准化后,对35份人工感染后的施氏鲟和健康施氏鲟进行检测,阳性的检出率分别为88.6%和14.3%,表明该技术不但可以检测已经发病的施氏鲟,而且还可以检测带菌的施氏鲟。     

四川省2018年春、秋季口蹄疫免疫抗体的监测及分析

于2018年春、秋季集中免疫后,从四川省21个市(州),每个市(州)随机抽取一个县(区)分别采集规模场和散养户的猪、牛、羊血清共4 318份,采用ELISA方法进行口蹄疫O型、Asia 1型、A型免疫抗体监测。结果显示,全省O型口蹄疫免疫抗体平均合格率为88.81%,其中猪血清的合格率为90.82%,牛、羊血清的合格率为85.14%;全省Asia 1型口蹄疫抗体合格率为85.48%;全省A型口蹄疫合格率为98.03%。     

汕头市中心城区生猪定点屠宰场临宰猪口蹄疫血清学监测报告

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型:A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型,以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型,我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型(云南保山型)。该病毒易变异,对外界环境抵抗能力强,对酸碱敏感。口蹄疫病毒复杂的血清型以及病毒毒株的不断变异,给该病的防疫工作带来很大的难度。目前汕头市猪口蹄疫主要以0型为主,尚未检测到A型病毒抗体,但其非结构蛋白抗体感染率较高。猪口蹄疫疫病是汕头市养猪场常见的传染性疫病之一。如何科学防控猪口蹄疫具有重要的公共卫生意义。     

应用RT-PCR技术检测动物组织中的口蹄疫病毒

为探究RT-PCR技术在口蹄疫病毒中的应用，采集4家养殖场不同猪、牛、羊群血清样本共300份，检测口蹄疫O/GX/09-7株，按照病料处理、标准品RNA制备、DNA的聚合酶链式扩增、回收纯化、感受态细胞制备、阳性菌液保存步骤，以仪器(试剂)默认值为参考，判断检测结果。检测结果表明猪阳性率病例数为2例，阳性病例占比为1.92%(2/104),牛羊阳性率较低，各为1例，阳性病例占比分别为0.98%(1/102)、1.06%(1/94),总检出率1.33%(4/300)。相关部门和技术人员应根据口蹄疫检测结果，依据阳性病例数量、日龄、高发时段、高发动物类型等，第一时间做好消毒、扑杀、净化等一系列处理工作，以进一步控制疫情蔓延。     

广西柳城县猪场口蹄疫三个滴度和猪瘟三个稀释度抗体水平调查

为了解柳城县猪场口蹄疫抗体和猪瘟抗体水平情况,采集2家猪血样检测口蹄疫O型抗体和猪瘟抗体水平,并且对比口蹄疫O型抗体在1:64、1:128和1:256滴度时抗体效价情况及猪瘟抗体在1:2、1:4和1:8稀释度时抗体水平情况。检测方法是用液相阻断-酶联免疫吸附法。检测结果是A猪场口蹄疫O型抗体在1:64滴度时合格率是100%、1:128滴度时合格率是100%、1:256滴度时合格率是40%,A猪场猪瘟抗体在1:2稀释度时合格率是100%、1:4稀释度时合格率是60%、1:8稀释度时合格率是40%。B猪场口蹄疫O型抗体在1:64滴度时合格率是100%、1:128滴度时合格率是100%、1:256滴度时合格率是87.5%,B猪场猪瘟抗体在1:2稀释度时合格率是87.5%、1:4稀释度时合格率是87.5%、1:8稀释度时合格率是87.5%。     

口蹄疫O-AsiaI型二价灭活疫苗免疫效果评价试验

随机抽取3个厂家的O-AsiaI型口蹄疫二价灭活疫苗进行免疫效果评价试验。于首免和加强免疫后28d进行检测,结果表明,加强免疫后28d口蹄疫O型病毒抗体合格率在93.33%以上,口蹄疫AsiaI型病毒抗体合格率在73.33%以上,三组疫苗免疫抗体合格率均达到农业部70%以上的要求,每种亚型内三组结果差异不显著,免疫效果整体良好。试验为量化评定采购的O-AsiaI型口蹄疫二价灭活苗提供了科学依据。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明,表达的VP3蛋白与天然的IPNVVP3蛋白一样具有相同的抗原性。试验利用原核表达系统成功地高效表达了IPNVVP3蛋白,融合蛋白以可溶性形式存在,并制备了高效价的抗血清。     

四川省2018年口蹄疫疫苗免疫效果评价

为了解四川省2018年口蹄疫疫苗免疫效果,随机抽取5个厂家的5种类型的口蹄疫疫苗进行免疫效果评价试验。在第二次免疫4周后检测口蹄疫抗体水平,结果表明:猪O型口蹄疫灭活疫苗、猪O型口蹄疫合成肽疫苗、猪O-A型口蹄疫二价灭活苗、牛羊O型-亚洲I型口蹄疫双价疫苗等4种类型的疫苗,各厂家疫苗的免疫抗体合格率均达到农业部规定70%以上要求;牛羊O型-亚洲I型-A型口蹄疫三价疫苗4个厂家的O型和A型抗体合格率均达到农业部规定70%以上要求,其中2个厂家的亚洲I型抗体合格率未达到70%以上。     

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白抗血清的制备及应用

应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH 5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白.经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57 kDa.Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别.用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA显示抗体效价可达1∶64 000.经制备的抗血清可以作为一抗建立ELISA检测方法,用于检测细胞悬液的病毒粒子,将抗血清稀释到1∶16 000仍能与IHNV全病毒发生反应.本研究利用重组的IHNV糖蛋白成功制备了高效价的抗血清,并能够与IHNV全病毒发生特异性结合,为IHNV免疫学检测方法建立奠定了基础.     

施氏鲟病原嗜水气单胞菌ELISA快速检测方法的研究

以施氏鲟(Acipenser schrenchii)细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测施氏鲟细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌的ELISA技术。结果显示:采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为107CFU/mL和1∶20000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达66.88%;交叉反应和阻断实验的结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了22份人工感染后的施氏鲟和健康施氏鲟,阳性检测率分别为90.9%和13.6%,表明该技术不仅能够检测已发病的施氏鲟,而且能够检测带菌的施氏鲟。     

武隆山羊弓形虫病感染性抗体检测与分析

为明确山羊弓形虫病在武隆地区的流行情况,通过颈静脉采血,分离血清样本,利用ELISA抗体检测法,对武隆地区多个乡镇的养殖场进行弓形虫感染性抗体的抽样检测与分析。结果表明,武隆地区存在山羊弓形虫病阳性病例,平均阳性检出率为48%;3种养殖模式中分散养殖模式的检出率最高(60%),专业羊场养殖模式检出率最低(38%);板角山羊、渝东黑山羊和波尔山羊的阳性检出率无明显差异;山羊的不同生长阶段中青年羊的阳性检出率高达56.7%。通过检测与分析,明确了山羊弓形虫病在武隆的流行趋势,也为该病的防控提供了理论依据。     

凡纳滨对虾红体病病原菌间接ELISA快速检测方法的研究

以凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌的ELISA技术。采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为106CFU·mL-1和1∶2000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达75.88%;交叉反应和阻断实验结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了30份人工感染后的凡纳滨对虾和健康凡纳滨对虾,阳性检测率分别为93.3%和13.3%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义。