Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

目的:探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.方法:运用生物信息学技术对let-7a靶基因进行预测和分析.构建含有UHRF1 3'UTR全长的野生型(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt)和突变型荧光素酶报告质粒(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut),分别将pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt,pmiR-RB-UHRF1-3'UTRmut,pmiR-RB-REPORT vector与let-7amimics或mimics control共转染293T细胞,双荧光素酶报告系统检测转染后293T细胞的荧光素酶表达水平.293T细胞分别转染let-7amimics和inhibitor,western blot和real-time RT PCR检测UHRF1基因的表达.结果:生物信息学结果显示let-7a有48个预测靶基因,包括UHRF1,HMGA2,MAPK6等,主要涉及microRNA在肿瘤、细胞周期、PI3K-AKT、p53等信号通路.其中UHRF1 3'UTR含有一个let-7a的结合位点,且在多个物种中呈高度保守.进一步双荧光素酶检测发现,共转染let-7amimics和pmiR-RBUHRF1-3'UTR-wt的293T细胞荧光素酶活性显著降低(p0.01).Western blot和real-time RT PCR结果显示转染let-7amimics的293T细胞UHRF1表达降低,而转染let-7ainhibitor的293T细胞UHRF1表达增高.结论:人肾上皮细胞293T中let-7a能通过与UHRF13'UTR靶向结合,负性调控UHRF1的表达.     

从江香猪LMF1基因的克隆、亚细胞定位及组织表达研究

为研究脂肪酶成熟因子1(LMF1)基因在从江香猪不同组织的表达情况及在真核细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR,Real-Time PCR,PSORT II Prediction软件结合荧光共定位的方法,克隆了从江香猪LMF1基因cDNA,构建了pEGFP-C1-LMF1真核表达载体,分析了LMF1基因在不同组织的表达差异和亚细胞定位情况.结果表明,从江香猪LMF1基因与GenBank上提交的其他猪种的同源性达到了100%;LMF1基因在脂肪中表达量最高,心中最低,且脂肪和小肠与其他7个组织相比,表达量均存在统计学意义(p0.01);荧光共定位结果表明,LMF1基因主要集中在细胞质中表达.相关结果对后续研究LMF1蛋白与其互作蛋白在脂质代谢的作用机理奠定的基础.     

菌根化马尾松磷转运蛋白家族基因的生物信息学和表达分析

利用同源克隆法从菌根化马尾松中获得14条磷转运蛋白基因片段,对其中6条(PmP1~PmP6)编码的氨基酸序列进行了比对和同源性分析,检测了不同磷水平下各成员的表达模式.结果表明,PmP1~PmP6编码氨基酸序列具有Pht1磷转运蛋白家族的典型特征,成员间相似性达70%以上.系统分析表明,它们分为5个亚组,与双子叶植物的同源性较高,且高度进化保守.综合分析半定量和荧光定量PCR结果显示,PmP1~PmP6的表达受外生菌根诱导,且根、茎和针叶中均有表达.未接种菌根真菌时,PmP1~PmP6在针叶中表达量最高,其次为根;接种后,根中表达活性升高,其表达量与生长环境中磷水平相关,低磷条件下被高效激活,高磷条件反而抑制其表达.因此,PmP1~PmP6参与菌根化马尾松体内磷的吸收和转运过程.     

弓形虫SAGⅠ基因的克隆与原核表达

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。     

运用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼前肾表达基因的敲除研究

CRISPR/Cas9是目前最热门的基因编辑技术,是进行基因敲除的有效手段.斑马鱼是一种常用的研究脊椎动物器官发育的模式生物,本实验选取10个斑马鱼前肾表达基因atp1a1a1,atp1a1a.2,atp1a1a.3,atp1a1a.4,atp1a1a.5,pkd2,aqp3a,bmper,isl2a和tbx2a,运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除以研究肾脏发育.经过三代筛选,每个基因获得了至少一种移码突变.突变体的初步表型分析显示,10个基因中只有atp1a1a.2和pkd2基因突变可以导致斑马鱼胚胎发育缺陷,隐性致死,这与已经报道的突变体或基因敲降结果类似.上述结果表明CRISPR/Cas9基因编辑技术可在斑马鱼中高效地进行基因敲除,获得的突变体为以后深入研究斑马鱼前肾发育提供了重要材料.     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。     

牛BMPRⅠA基因cDNA的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆牛BMPRⅠA基因cDNA全长,以进行生物信息学分析和组织表达谱研究。【方法】运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,对牛BMPRⅠA基因进行cDNA全长克隆和生物信息学分析,并通过RT-PCR方法进行了组织表达谱研究。【结果】克隆得到了牛BMPRⅠA基因4 067 bp的cDNA全长序列,通过核酸序列分析发现,该基因编码532个氨基酸,与人、黑猩猩、小鼠、大鼠、犬和红原鸡在核酸序列上分别有91%,93%,89%,88%,91%和82%的同源性;在氨基酸序列上分别有97%,95%,96%,95%,97%和91%的同源性。通过生物信息学分析发现,牛BMPRⅠA蛋白包含一个信号肽序列和一个跨膜区序列,其成熟蛋白可能位于细胞膜上。在牛卵巢、肝、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心肌、肺、胰腺、睾丸、乳腺、瘤胃、脾脏、淋巴、胸腺等组织中都检测到有BMPRⅠA基因表达。【结论】牛BMPRⅠA基因是一个功能重要、进化保守的基因,具有广泛的组织表达谱。     

新疆牛环形泰勒虫TamsⅠ基因原核表达条件的优化及蛋白纯化

为了提高新疆牛环形泰勒虫TamsⅠ基因在大肠杆菌中的表达量,研究了温度、诱导时间以及诱导剂（IPTG）浓度等不同条件对TamsⅠ融合蛋白表达量的影响。试验结果表明,大肠杆菌菌株BL21（DE3）在37℃培养2．5h后,使用终浓度为2mmol／L的IPTG在25℃振荡诱导培养8h时,GST—TamsⅠ融合蛋白表达量最高,达到2．5rmg／mL。用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST—TamsⅠ融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE检测表明GST-TamsⅠ融合蛋白大小约为56kl）,与预计的分子量大小一致。TamsⅠ基因的优化表达为牛环形泰勒虫病的分子免疫学诊断和哑单位疫苗的研制奠定了基础。     

具有 Beddington-DeAngelis功能反应及恐惧效应的捕食系统

针对具有恐惧效应的捕食系统,考虑Beddington-DeAngelis(B-D)功能反应,构建并分析了模型的动力学性质.给出了平衡点的存在条件,并通过Hurwitz判据、Lyapunov函数和Dulc函数对平衡点的局部及全局稳定性进行了分析.     

绵羊IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ R基因特征分析及其在肌肉组织中的表达差异

为了比较IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因在绵羊肌肉中的表达差异,根据GenBank公布的绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA序列设计特异性引物,采用实时定量PCR方法检测其在甘肃‘高山细毛羊’及其与南非肉用‘美利奴’杂交F1代(南甘F1代)羔羊肌肉组织中的表达量.利用生物信息学软件分析了绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因结构,并构建系统进化树,探讨了其生物学功能.结果表明:南甘F1代羔羊肌肉组织中IGF-Ⅰ基因的表达量显著高于‘甘肃高山细毛羊’(P0.05),而IGF-ⅠR基因的表达量在南甘F1代羔羊和‘甘肃高山细毛羊’肌肉组织中没有显著变化(P0.05).绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因分别含有465bp和4 518bp的完整开放阅读框,编码154个和1 505个氨基酸;其蛋白质分子量分别为17 011.71U和169 267.26U,等电点分别为9.36和6.70;IGF-Ⅰ基因信号肽切割点分别位于49~50位氨基酸之间,而IGF-ⅠR基因不含信号肽;IGF-Ⅰ基因编码产物的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主,位于细胞核的可能性最高(62.5%);IGF-ⅠR基因编码产物的二级结构主要以无规则卷曲为主,位于细胞质的可能性最高(34.8%);IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因分别作为激素和信号传感器参与机体生物学过程.     

具有开放骨架双核锌羧酸配合物的设计合成与结构表征

选择含氮的有机羧酸配体1,3-di(3’,5’-dicarboxylphenyl)pyridine(C_(21)H_(13)NO_8,H_4L),与过渡金属锌在DMA/CH_3CN/H_2O的混合溶剂热体系中配位组装,合成了一例具有3D开放骨架结构的双核锌金属羧酸配位化合物———Zn_2(C_(21)H_9NO_8)(H_2O)(配合物1).用单晶X-射线衍射分析确定了其晶体学结构,配合物1结晶在正交晶系,P2_12_12_1空间群(No.19);有机羧酸衍生物配体H_4L结构中的羧酸氧原子与金属锌螯合配位形成1个双核锌的次级结构单元,再通过有机配体的配位作用连接形成配合物1的三维开放骨架结构,沿y轴方向具有空旷的孔道结构.     

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu／67株的MDBK细胞中扩增gD基因，将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析，设计合成3对引物，以获得的克隆质粒为模板，PCR扩增gD胞外域基因，将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ、pET—gDQB、pET—gDHB，利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21（DE3），IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小，Western blot表明表达产物均有抗原性。     

12株牛源肺炎克雷伯菌ESBLs类抗生素的耐药性与耐药基因检测

为了解重庆地区12株牛源肺炎克雷伯菌的超广谱β-内酰胺酶耐药性及ESBLs基因型分布情况,该试验采用纸片扩散法对12株肺炎克雷伯菌进行超广谱抗菌药物的敏感性检测,通过PCR方法检测其所产生的耐药基因类型.结果表明:12株菌对阿莫西林、氨苄西林的耐药率均为100%,头孢噻吩和先锋霉素Ⅴ的耐药率为17%,头孢曲松的耐药率为0%.产ESBLs菌株3种耐药基因TEM,SHV,CTX-M的检出率分别为100%,42%,67%,以TEM的检出率最高.     

外源ABA对木薯叶片内源激素及淀粉合成相关基因的影响

在盆栽条件下,用外源脱落酸(Abscisic acid,ABA)处理块根形成期的木薯品种,测定处理及对照在不同时刻叶片中ABA等激素变化、ABA合成与失活以及淀粉合成途径关键基因的表达变化。结果表明:1)正常条件下木薯叶片内源ABA水平及ABA合成途径基因均存在明显的夜间低而白天较高的昼夜节律,ABA信号转导相关基因也表现出下午的高峰表达,它们与淀粉合成途径基因的夜间表达一般具有相反的趋势。2)ABA处理后,木薯叶片内源ABA含量迅速下降,与观察到的ABA合成途径基因表达下降与后期ABA失活基因激活表达相一致,同时发现细胞分裂素中的玉米素核苷(Zeatin riboside,ZR)和生长素(Indole acetic acid,IAA)水平发生改变,预示木薯具有迅速恢复ABA平衡态的机制,并且与其他类激素存在协同作用。3)与此同时,外源ABA处理明显抑制淀粉合成上游基因表达,特别是夜晚高峰期的表达,而对下游基因的抑制相对较小。说明这些基因及相关酶类不同程度受到ABA的调控;ABA明显倾向于调控淀粉合成上游相关基因;外源ABA处理改变了叶片临时淀粉合成速率。     

猪传染性胃肠炎病毒 M 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.     

郏县红牛POU1F1基因第6外显子HinfⅠ、AluⅠ和PstⅠ位点遗传变异及其与生长发育的关系

【目的】研究POU1F1基因第6外显子HinfⅠ、AluⅠ和PstⅠ酶切位点多态性对郏县红牛生长发育性状的遗传效应。【方法】以144头郏县红牛为研究材料,用PCR-RFLP方法检测POU1F1基因第6外显子HinfⅠ、AluⅠ和PstⅠ基因座多态性,并分析其基因型间遗传变异与生长发育的关系。【结果】451bp的POU1F1基因第6外显子片段被HinfⅠ酶切后表现多态;AA、AB和BB基因型频率分别为0.1875,0.3056和0.5069,A和B等位基因频率分别为0.3403和0.6597,处于Hardy-Weinberg不平衡状态;该位点纯合度为0.5510,杂合度为0.4490,有效等位基因数为1.8148,多态信息含量为0.3482,属中度多态,可作为该群体遗传资源评价的建议性指标。而POU1F1基因第6外显子AluⅠ和PstⅠ基因座均未检测到多态性,仅发现AA基因型,表明这些基因座比较保守。HinfⅠ多态性与郏县红牛生长发育性状的相关分析表明,不同基因型与郏县红牛体高、腰角宽、胸围、尻长、十字部高、管围、体质量等指标均无显著相关性(P>0.05);BB基因型个体体长显著高于AB和AA基因型个体(P<0.05),提示B等位基因可能对体长有显著影响。【结论】BB基因型可作为郏县红牛体长性状标记辅助选择的DNA标记。     

鹅肌肉IGF-Ⅰ基因mRNA的表达

以吉林白鹅肉用品系、蛋用品系和霍尔多巴吉白鹅为供试材料,采用实时定量PCR法对胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因在鹅1、30、60、90日龄时胸肌、腿肌中mRNA的表达水平进行测定分析。结果表明:鹅胸肌、腿肌IGF-ⅠmRNA的表达量随着日龄的增加呈先升后降的趋势,胸肌中IGF-ⅠmRNA的表达峰值在吉林白鹅肉用品系60日龄、蛋用品系30日龄、霍尔多巴吉白鹅60日龄出现,其中霍尔多巴吉白鹅30日龄与1日龄差异不显著(P>0.05);腿肌IGF-ⅠmRNA的表达量均在30日龄达到最大,随后下降。在胸肌组织中,吉林白鹅肉用品系IGF-ⅠmRNA的表达量在1、60和90日龄时均高于蛋用品系,霍尔多巴吉白鹅IGF-ⅠmRNA表达量在1日龄和90日龄时高于吉林白鹅蛋用品系(P<0.05),30日龄品种间差异不显著(P>0.05)。在腿肌组织中,吉林白鹅肉用品系IGF-ⅠmRNA在30和60日龄的表达量均高于霍尔多巴吉白鹅,在60和90日龄高于吉林白鹅蛋用品系(P<0.05);霍尔多巴吉白鹅在30日龄时IGF-ⅠmRNA表达量低于蛋用品系(P<0.05),90日龄时高于吉林白鹅两个品系(P<0.05),1日龄时表达水平无差异(P>0.05)。     

运动员的深智慧态度、意志品质及运动焦虑间的关联特征研究

为探讨运动员深智慧态度、意志品质及运动焦虑三者间的关系,寻找减少运动焦虑、提高运动成绩的有效途径,以青少年运动员为研究对象,采用探索性因子分析、验证性因子分析、相关分析、多元逐步回归等方法对问卷调查所得数据进行统计分析,结果显示:运动员意志品质中的控制与信心2个特质与运动焦虑呈负相关,而意志品质中的控制、信心及承诺特质与深智慧态度的5个维度呈正相关;深智慧态度中的内部联系原理、循环进化原理、对立与互补原理、矛盾原理、低深原理与空无原理皆能有效预测意志品质中的3个特质;深智慧态度对意志品质具有正向预测力(路径标准化系数为0.45),同时对运动焦虑具有反向预测力(路径标准化系数为-3.7),意志品质对运动焦虑也具有反向预测力(路径标准化系数为-0.52).认为具有深智慧态度的运动员其缓解运动焦虑的能力更强,且通过提升意志品质进而降低运动焦虑的能力也更强.意志品质在深智慧态度对运动焦虑的预测作用中起着中介调节效应,其预测力高于深智慧态度对运动焦虑的直接预测力.