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1.
为了探明肌肉抑制素(Myostatin)是否通过抑制骨骼肌生长发育并诱导卫星细胞分化为肌成纤维细胞导致骨骼肌的纤维化,试验以3周龄健康C57小鼠为材料,分离培养骨骼肌卫星细胞至汇集度为80%~90%,加入含有不同浓度Myostatin的培养基进行分化刺激;对刺激后3 d的样品,利用Western-blot方法检测肌成纤维细胞标记蛋白α-SMA、Fibronectin和成肌细胞标记蛋白MyoD、Myogenin的变化;同时利用免疫荧光染色方法显示Myostatin刺激分化5 d后成肌细胞分化融合率(eMyHC/Dapi)以及肌成纤维细胞的比率(Fibronectin/Dapi)。结果表明:随着Myostatin刺激浓度的升高,骨骼肌卫星细胞分化为成肌细胞的能力逐渐下降,融合能力减弱;而分化为肌成纤维细胞的能力增强,说明Myostatin能够通过抑制骨骼肌再生并诱导卫星细胞分化为肌成纤维细胞导致骨骼肌的纤维化。  相似文献   

2.
牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40 d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403 bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物,建立PCR 反应体系进行性别鉴定.结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖;阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255 bp的片段和403 bp的β-珠蛋白基因片段,第2,3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403 bp的β-珠蛋白基因片段,通过电泳证明PCR产物255 bp的片段为SRY基因片段,说明有255 bp扩增带的细胞系为雄性;无255 bp扩增带的细胞系为雌性.结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养,利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定.  相似文献   

3.
为了研究改变泛素化蛋白水平对牛骨骼肌卫星细胞体外增殖与成肌分化的影响,试验利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,采用1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132处理改变牛骨骼肌卫星细胞泛素化蛋白水平,同时设空白对照组和DMSO对照组,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞的密度,利用Western-blot技术检测牛骨骼肌卫星细胞蛋白泛素化水平的变化,综合筛选MG132的最佳处理浓度;然后通过EdU增殖检测法检测MG132对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;最后通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,利用Western-blot技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyHC的表达情况,综合分析MG132对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。结果表明:牛骨骼肌卫星细胞经不同浓度MG132处理后,空白对照组和DMSO对照组之间细胞密度和蛋白泛素化水平没有明显变化,添加MG132后蛋白泛素化水平明显升高,随着添加浓度的增加对牛骨骼肌卫星细胞生长的抑制作用逐渐增强,综合分析选用1.25μmol/L的MG132进行细胞增殖和分化调控研究;经MG132处理后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率显著低于DMSO对照组(P0.05),诱导分化后的牛骨骼肌卫星细胞形成的肌管数量呈增多趋势,成肌分化标志因子MyHC的表达显著高于DMSO对照组(P0.05)。说明MG132可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进牛骨骼肌卫星细胞的分化。  相似文献   

4.
为了研究兔骨骼肌卫星细胞体外分离培养及成肌诱导分化效果,试验采用1日龄幼兔腿部肌肉组织,利用胶原酶联合胰酶消化法分离肌卫星细胞,采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化,对纯化后的兔骨骼肌卫星细胞进行低血清诱导分化,于培养皿中培养至形成成熟肌管,观察肌管形成状态,分别采用RT-PCR及免疫荧光染色方法对成肌分化标志性基因肌细胞生成素(Myo G)和肌球蛋白重链(MHC)进行检测。结果表明:新分离出的兔骨骼肌卫星细胞呈梭形,折光性强,2%马血清分化培养液培养3 d后开始出现大量肌管,状态良好,大部分肌管出现收缩跳动现象。RT-PCR检测结果显示,Myo G基因在肌管中表达量较高,在未分化的兔骨骼肌卫星细胞内未表达。免疫荧光染色结果显示,MHC基因在成熟肌管内呈阳性表达。  相似文献   

5.
为研究天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-组氨酸盒解旋酶9 (DEAH (Asp-Glu-Ala-His)-box helicase 9,DHX9)对牛骨骼肌细胞增殖与分化的影响,利用已经建立的牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化模型,设计合成DHX9的si-RNA,采用荧光定量PCR和Western blot技术检测DHX9基因在成肌...  相似文献   

6.
为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P0.05;P0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。  相似文献   

7.
为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P<0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。  相似文献   

8.
试验旨在分离绵羊骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells,SMSCs),建立绵羊SMSCs体外分离、培养及鉴定体系,为后续研究提供种子细胞。以新生健康绵羊为试验动物,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步酶消化法和差速贴壁法分离并纯化SMSCs。用RT-PCR和免疫荧光法鉴定SMSCs标记基因配对盒基因7(paired box 7,Pax7)、结蛋白(Desmin)和生肌调节因子1(myogenic regulatory factors 1,MyoD1)的表达情况;用血清撤离法诱导SMSCs向成肌细胞方向分化,成肌诱导后观察肌管的形成,免疫荧光法检测成肌分化特异性标志肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的表达。RT-PCR结果显示,扩增条带与预期相符,所分离细胞表达SMSCs标记基因Pax7、DesminMyoD1;免疫荧光鉴定结果显示,所分离细胞表达SMSCs标记蛋白Pax7、Desmin和MyoD1;成肌诱导后镜下可见细胞相互融合形成多核的肌管,并表达成肌特异性标志MHC。本试验分离了绵羊SMSCs,建立了适用于绵羊SMSCs的体外培养体系,并成功进行了成肌诱导分化,为今后研究绵羊骨骼肌生长发育机制提供了试验材料和技术支撑。  相似文献   

9.
为了探究泛素结合酶2N(ubiquitin-conjugating enzyme 2N, UBE2N)对牛骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells, MSCs)增殖和分化的影响,试验采用天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室冻存的牛MSCs建立成肌分化模型,设计UBE2N的siRNA(si-UBE2N)构建UBE2N的干扰模型,转染牛MSCs,并以转染si-NC作为对照;采用qRT-PCR和Western-blot方法分别检测转染后对UBE2N基因和蛋白表达的干扰效果;采用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测si-UBE2N对牛MSCs增殖的影响;在荧光倒置显微镜下观察分化期(DM期)牛MSCs的肌管形成状态,通过qRT-PCR和Western-blot方法分别检测MSCs中肌细胞生成素(MyoG)和肌球重链蛋白(MyHC)基因和蛋白表达水平,分析转染si-UBE2N对牛MSCs分化的影响。结果表明:与对照组相比,转染si-UBE2N后UBE2N基因和蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。干扰UBE2N后经EdU染色发现,牛...  相似文献   

10.
为了阐明FGF10基因对山羊成肌细胞分化的影响,试验以简州大耳山羊羔羊的成肌细胞为研究对象,体外培养并诱导分化为肌管,采用实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因在诱导分化过程中的表达水平;同时采用腺病毒过表达和SiRNA干扰技术、形态学观察和实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因功能获得和缺失对成肌细胞中肌管形成的影响,以及分化相关基因MyoD1、Myf5、Myf6、MyoG的表达情况。结果表明:成肌细胞在分化第2~4天时,出现大量肌管,诱导分化成功。FGF10基因随着成肌细胞分化时间的延长呈现先升高后下降的趋势,且在诱导分化第2天时极显著高于分化前(P<0.01)。过表达FGF10基因时成肌细胞中的肌管形成减少,极显著下调MyoD1(P<0.01)和显著下调Myf5(P<0.05)基因的相对表达水平;而干扰FGF10基因时成肌细胞中的肌管形成增加,极显著上调MyoG(P<0.01)和显著上调Myf5(P<0.05)基因的相对表达水平。说明FGF10基因可能是山羊成肌细胞分化的负调控因子。  相似文献   

11.
为了阐明FGF10基因对山羊成肌细胞分化的影响,试验以简州大耳山羊羔羊的成肌细胞为研究对象,体外培养并诱导分化为肌管,采用实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因在诱导分化过程中的表达水平;同时采用腺病毒过表达和SiRNA干扰技术、形态学观察和实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因功能获得和缺失对成肌细胞中肌管形成的...  相似文献   

12.
为了探讨miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响,试验将分离培养的牛骨骼肌卫星细胞接种在6孔板中,待细胞汇合度为70%时,用PEI转染miR-181a的模拟物miR-181a-M、抑制剂miR-181a-I、模拟物对照miR-181a-M-NC和抑制剂对照miR-181a-I-NC进入牛骨骼肌卫星细胞中,在0,1,2,3天用Western-blot检测肌肉有关分化蛋白MyoD、MyoG和MYH3以及靶基因HOX-A11蛋白的表达量,用免疫荧光法检测细胞肌管的数量。结果表明:在牛骨骼肌卫星细胞中,转染miR-181a模拟物的牛骨骼肌卫星细胞,有关肌肉分化蛋白质如MyoD、MyoG和MYH3的表达量明显增加,细胞肌管数量显著增多,进一步证实miR-181a促进细胞的分化。在双荧光素酶报告系统中,miRNA-181a和HOX-A11基因的3'-UTR结合时荧光素酶活性明显下降,miRNA-181a和突变的3'-UTR结合时荧光素酶活性没有下降。说明HOX-A11是miR-181a的靶基因,miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞的分化具有促进作用。  相似文献   

13.
【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells, BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因...  相似文献   

14.
喻世刚  王钢  廖娟  谢伟 《中国畜牧兽医》2021,48(8):2713-2726
试验旨在挖掘高肌内脂肪(IMF)含量和低IMF含量鸡胸肌中差异表达的microRNA(miRNA)(DEM),以期从miRNA角度探究鸡IMF沉积的分子调控机制。以120只沐川乌骨黑鸡为研究对象,采用高通量测序分别完成3个IMF含量极高(H组)和极低(L组)鸡胸肌组织的miRNA测序,测序结果经生物信息学分析,鉴定H和L组中差异表达的miRNAs,随机选择6个miRNAs进行实时荧光定量PCR验证。IMF含量测定结果表明,每只鸡平均100 g胸肌中IMF含量为4.08 g,H和L组IMF含量存在极显著差异(P<0.01);6个测序文库结果表明,每个测序文库获得Clean reads均超过10 000 000条,Clean reads占Raw reads的百分比>93%,21~23 nt的small RNA(sRNA)数量占总sRNA的百分比>50%,其中22 nt长度的sRNA所占比例最高,平均GC碱基含量为48.95%,获得的测序数据可靠;6个测序文库中sRNA注释为rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及重复序列的比例较低,分别为2.74%、1.85%、6.21%、1.58%、2.82%和2.81%;6个测序文库共鉴定已知miRNAs成熟体578个,miRNAs前体500个,鉴定差异表达的miRNAs 23个,其中H组中上调表达的miRNAs有16个,下调表达的miRNAs有7个;miRNA靶基因预测分析结果表明,23个差异表达miRNAs共预测靶基因628个;GO分析结果表明,共鉴定了30个显著富集GO条目,包括6个细胞成分、13个生物学过程和11个分子功能;KEGG富集分析表明,差异表达miRNA的靶基因显著富集于胰岛素信号通路、半乳糖代谢、脂肪细胞因子信号通路、鞘糖脂生物合成、糖酵解及淀粉和蔗糖代谢;实时荧光定量PCR结果表明,gga-miR-124a-3p、gga-let-7a-5p在H组中表达量极显著或显著高于L组(P<0.01;P<0.05);gga-miR-19a-3p在H组中表达量极显著低于L组(P<0.01),gga-miR-6553-3p和gga-miR-128-3p在H组中的表达量显著低于L组(P<0.05),其表达趋势与测序结果一致。以上结果表明,差异表达的miRNA gga-miR-124a-3p、gga-let-7a-5p、gga-miR-6553-3p、gga-miR-128-3p和gga-miR-19a-3p参与脂肪生成,是鸡IMF含量调控重要的候选miRNAs,为阐释miRNA调控鸡IMF沉积分子机制提供理论基础。  相似文献   

15.
牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养   总被引:2,自引:1,他引:2  
本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻、解冻后细胞可继续传代  相似文献   

16.
牛胎儿成纤维细胞的分离培养   总被引:1,自引:0,他引:1  
研究了牛胎儿组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征,并对培养细胞的冷冻保存和复苏进行了观察.采取组织块培养法进行原代培养,在接种第5天到第6天成纤维细胞生长旺盛;用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养细胞生长状态良好;用液氮冷冻法保存传代细胞,解冻后持续传代至第12代仍生长良好,第8代细胞冻存前和复苏后的活率分别为97.0% 和94.3%,无显著差异(P>0.05);分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常;成功地建立了牛胎儿成纤维细胞系.该细胞可经多次传代培养和冷冻保存.  相似文献   

17.
分别采用机械分离法和酶消化分离法从胎龄为3个月的牛胎儿脑组织中分离培养牛神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),比较这2种方法对NSCs培养的影响。根据培养液中是否添加bFGF、EGF和FBS,选择不同的培养液培养NSCs,观察不同培养液对NSCs培养的影响,进而筛选出最适培养液。对NSCs及经诱导分化成的神经细胞进行生物学特性分析,包括细胞形态学观察和细胞免疫荧光检测。结果显示:组成成分为Neurobasal Medium+20μg/L bFGF+20μg/L EGF+20mL/L B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素的神经干细胞培养液能够很好地支持牛胎儿NSCs的存活和增殖;机械分离法获得的牛胎儿NSCs的神经球数量和细胞活性要比酶消化分离法效果好;NSCs特异性标志物Nestin表达呈强阳性,Sox2、Nanog、Oct4和SSEA4等干细胞表面标志表达均呈阳性;经体外诱导的NSCs可分化为星形胶质细胞(表达GFAP)和神经元(表达βⅢ-tubulin)。结果表明,可从牛胎儿脑组织中分离培养出NSCs,NSCs可长期传代培养,具有分化功能。牛NSCs为克隆牛的供体细胞和转基因牛的受体细胞提供了细胞新来源。  相似文献   

18.
郭强  王英哲  陈晶晶  周仂  徐博 《草地学报》2019,27(5):1138-1146
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种多年生豆科苜蓿属牧草,利用紫花苜蓿细胞质雄性不育系育种有着重要意义,相关microRNA的鉴定工作是研究其分子机制的重要内容。本试验以培育的紫花苜蓿细胞质雄性不育系MSGN1A及其同型保持系MSGN1B的花蕾为试验材料,采用small RNA测序技术对MSGN1A及MSGN1B在花药发育阶段的鉴定差异表达microRNA以及差异表达microRNA靶基因功能进行注释。结果表明:共计检测到1 478个miRNA,其中known miRNA 1 351个,novel miRNA 127个;筛选出差异表达miRNA 130个,包括90个上调表达的miRNA和40个下调表达的miRNA;差异表达micro RNA靶基因主要涉及的通路有:“代谢过程”、“细胞过程”、“信号生物过程”、“植物激素信号传导”、“氧化磷酸化”和“淀粉蔗糖代谢”等。差异表达microRNA靶基因的功能主要是调控花药的发育,其次是调控花期以及信号传导,而差异表达microRNA靶向的转录因子中多为控制花期、花药发育和信号传导等过程的因子,对不育系的败育起到一定的影响。  相似文献   

19.
为了在体外细胞水平模拟多浪绵羊肌肉生长发育过程,本研究以多浪绵羊为试验动物,采用胶原酶和胰酶两步酶消化法分离多浪绵羊骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs),并利用差速贴壁的方法纯化分离得到的SCs。利用免疫荧光技术检测SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的表达情况,鉴定分离得到的SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs向成肌方向分化。通过显微镜观察和成肌分化标记基因肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的免疫荧光,检测肌管的形成情况。通过对SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的免疫荧光鉴定,确认本研究成功分离得到多浪绵羊SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs成肌分化,显微镜观察和MHC免疫荧光可以明显观察和检测到肌管的形成。本研究对多浪绵羊SCs成功地进行了分离和鉴定,并建立了体外培养条件下多浪绵羊SCs的成肌诱导分化。  相似文献   

20.
利用胶原酶消化法分离18月龄延边牛前体脂肪细胞进行体外培养和鉴定,用100μmol/L油酸对细胞进行诱导分化,研究油酸对脂肪细胞分化的作用。结果显示,油酸可诱导延边牛前脂肪细胞分化,促进脂滴形成及甘油三酯浓度增加;成脂相关基因PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β、SREBP1及PLIN2的表达随处理时间不同表现出不同的变化趋势,PPARγ、C/EBPα、CPT1β、SREBP1、FABP4和PLIN2基因的表达量在分化后始终高于对照组(P<0.05),LPL基因的表达先降后升(P<0.05),SCD基因的表达始终低于对照组(P<0.05)。结果表明,油酸可促进延边牛前体脂肪细胞的分化,并对成脂相关基因具有明显的调控作用。  相似文献   

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