绵羊季节性繁殖的神经内分泌研究进展

季节性繁殖是动物适应自然环境变化的一种策略,通过在合适的时间繁殖来保证后代的存活和生长,GnRH神经元对雌激素负反馈响应的显著变化是调节季节性繁殖的主要原因。近年来,科学家对绵羊季节性繁殖的神经和神经内分泌调控进行了大量研究,主要集中在下丘脑褪黑激素及相关神经元的活动。本文综述了绵羊季节性繁殖的传入信号和神经通路,简要比较了绵羊和仓鼠季节性繁殖的相关研究,为绵羊季节性繁殖神经机制研究提供参考。     

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定

采用倒置相差显微镜、环境扫描电子显微镜对新生24h内SD大鼠大脑皮质原代培养的神经元进行了形态学观察，建立了大脑皮质神经元原代培养方法。应用2．5μg／mL阿糖胞苷（Ara-C）对培养3d的神经元进行24h干预，去除神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等杂质细胞，以提高神经元产率；用Nissl’s染色法进行神经元鉴定；利用微量滴定（MTT）法测定了一个培养周期（约10d）的神经元活性分布。光学显微镜观察结果表明，培养至第4h绝大多数神经元已贴壁生长，胞体上可见1～2个细小突起；培养至第3d、第6d时，Nissl’s染色结果显示，加Aralc能显著提高神经元纯度（≥929／6）；MTT结合形态学观察结果表明，神经元培养至第6d时活性最强，细胞呈卵圆形、蜘蛛状、锥体状等多种形态，细胞胞体饱满，光晕明显，神经网络形成完整。     

新生Wistar大鼠海马神经细胞的体外培养与鉴定

为探讨原代Wistar大鼠海马神经细胞的体外培养方法,本研究取新生24 h内的Wistar大鼠海马组织,无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,逐日在倒置相差显微镜下观察。结果发现,从海马组织中分离出的神经细胞具有增殖能力,细胞对数生长期为2~8 d,最长培养30 d;细胞经免疫荧光鉴定Nestin表达呈阳性;免疫组织化学结果显示,在传代培养细胞的胞体和突起均有NF阳性标记物,GFAP抗体和CD68抗体显色均为阴性。由此可见,分离培养的细胞是具有自我更新增殖和多分化潜能的神经元细胞。     

可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)在绵羊下丘脑中的分布

可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)是一类具有调控动物食欲和体质量等生理功能的重要因子。但有关CART神经元在绵羊下丘脑的分布部位和基本神经投射通路尚无报道,限制了对其潜在功能的进一步研究。本试验以绵羊下丘脑为研究材料,运用免疫荧光技术研究CART神经元在下丘脑的分布。结果表明,CART神经元集中分布在绵羊下丘脑腹内侧视前核(ventromedial preoptic nucleus,VMPO)区域,且均有较为明晰的神经元胞体及纤维结构,与小鼠CART神经元的分布部位有明显的差异,但公母绵羊之间没有明显的分布差异。这一结果为进一步研究CART在绵羊机体能量代谢平衡中的生物学作用奠定了基础。     

神经胶质细胞对GnRH神经元的调控机制研究进展

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)神经元是控制生殖的主要神经元。下丘脑GnRH神经元的适时激活,兴奋性和抑制性信号跨突触传递的严格控制,决定了性腺发育和成年个体的繁殖能力。研究表明,神经胶质细胞是调控GnRH神经元的主要细胞,神经胶质细胞利用胞体和突起,通过多种细胞和分子机制调控GnRH神经元,包括分泌旁分泌因子调控GnRH神经元,通过黏合分子和具有重塑性的神经胶质细胞覆盖GnRH神经元来完成神经胶质细胞和GnRH神经元之间的接触依赖性通讯。论文对神经胶质细胞调控GnRH神经元活性和分泌的机制进行了综述,以期对神经胶质细胞在生殖调控中的作用有更深入的了解。     

不同水平酪氨酸对体外培养绵羊下丘脑神经细胞分泌GnRH的影响

实验旨在验证脑内神经递质酪氨酸(Tyrosinase,Tyr)通过调控多巴胺的合成,作用于下丘脑神经细胞分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)能够引起绵羊发情的可能浓度和机制。本实验分别对绵羊下丘脑神经细胞采用0(对照组)、0.02、0.2、2 mmol/L Tyr处理,24 h后检测绵羊发情相关基因DRD1蛋白、mRNA表达量及GnRH水平。结果表明:0.2mmol/L Tyr组DRD1蛋白、mRNA表达量及GnRH水平均高于其他处理组(P0.05),0.02、0.2、2 mmol/L Tyr组的GnRH水平较对照组分别提高12%(P0.05)、29%(P0.01)、-35%(P0.05)。可见,绵羊下丘脑神经细胞中0.2 mmol/L Tyr可高效率调控多巴胺的合成,其作用于基因DRD1进而放大GnRH效应,为诱导绵羊发情的内分泌机制研究提供科学依据。     

IFN-γR和ER在大鼠下丘脑中的共存

为了探讨神经-免疫-内分泌网络中生物活性物质间相互调节和平衡的关系,本试验应用免疫组化双标记法对成年SD雌性大鼠下丘脑中IFN-γ受体（IFN-γR）和雌激素受体（ER）的共表达进行了研究。结果发现,IFN-γR和ER广泛存在于大鼠下丘脑中,其中在视前交叉上核、视前内侧核、室周核、交叉上核、下丘脑前核、下丘脑内侧核、下丘脑外侧核、乳头体前背侧核、乳头体前腹侧核等13个核团中存在大量的IFN-γR和ER双标记细胞,双标记细胞约占全部阳性标记细胞的60．9％;双标记细胞胞质呈黑褐色、胞核呈棕黄色;ER单标着色细胞以神经胶质细胞居多。研究结果表明,IFN-γ和雌激素可以分别以其各自受体为介质进行信号传递和信息整合,同时也通过在同一细胞中的相互作用而参与机体的神经-免疫-内分泌调节。     

猪原代神经细胞的体外培养与鉴定

为建立猪原代神经细胞体外培养及鉴定方法,本研究选取90日龄潜江黑猪1头,分离猪脑组织,无菌剪碎后采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备神经细胞悬液,进行培养,逐日在倒置相差显微镜下观察,并用间接免疫荧光鉴定。结果显示,培养72h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起变长并交错呈网络,培养至15~20d神经细胞状态最佳,随后逐渐老化,神经细胞可生长30d,经鉴定Nestin表达呈阳性。本研究建立的方法适合一般实验室开展猪原代神经细胞的培养与初步鉴定。     

鸡脑催乳素免疫反应神经元的分布

运用ＡＢＣ法观察了催乳素（ＰＲＬ）免疫反应神经元在鸡脑的分布。结果,ＰＲＬ阳性胞体主要分布在视交叉上核、视前室旁核、视上核、下丘脑室旁核、弓状核和伏隔核,旧纹状体、正中隆起存在大量阳性纤维末梢,在侧脑室腹侧的室管膜和脑基底神经胶质板上也存在ＰＲＬ阳性神经元。视前室旁核、视交叉上核、下丘脑室旁核、弓状核等核团内的ＰＲＬ阳性神经元有突起向第三脑室投射,伏隔核内及侧脑室室管膜上的ＰＲＬ阳性神经元有突起伸至侧脑室,视上核的ＰＲＬ阳性神经元也有突起投射至脑基底神经胶质板,表明鸡脑内的ＰＲＬ可以释放入脑室系统,参与调节脑－脑脊液神经体液回路。     

铅镉联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞形态学损伤的研究

为了观察铅、镉及其联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞的形态学影响,本试验通过对原代培养的新生大鼠大脑皮质神经细胞经提取、纯化和鉴定后,分九组进行单独或联合染毒,染毒时间为12 h,显微镜观察神经细胞形态并测量其胞体短直径和突起长度的变化.结果显示,与对照组相比,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少;各试验组神经细胞胞体短直径显著减小(P<0.05),突起长度显著变短(P<0.05);随铅、镉单剂量作用浓度的增加,神经细胞胞体短直径和突起长度有减小趋势,但组问差异不显著(P>0.05).与相应铅、镉单独染毒组比较.各铅镉联合染毒组神经细胞胞体短直径减小、突起长度变短更加明显,部分组间差异显著(P<0.05).结果表明,铅、镉作用浓度与神经细胞形态改变存在明显的剂量一效应关系,铅镉联合表现协同毒性效应.     

家畜诱发发情与超数排卵

<正>诱发发情的主要方法是利用外源激素,如促性腺激素或生理活性物质以及环境条件的刺激,通过内分泌和神经的作用激发卵巢机能,使卵巢从相对静止状态转为活动状态,促使卵泡生长发育继而使母畜表现发情并予配种。家畜的一切性活动始终是在内分泌和神经系统的作用下进行的。治疗发情除激素处理外,神经刺激也可使性机能趋于活跃,如环境条件的改变等方法提高性机能,促进发情。1绵羊的诱发发情绵羊属于季节性繁殖的动物,在休情期内或产     

和田羊大脑皮质神经细胞体外培养及鉴定

以出生24 h的和田羊羊羔为实验对象,利用胰蛋白酶消化大脑皮质组织后采用贴壁法纯化细胞后进行体外培养,并通过形态学观察、Nissl′s染色、NSE/Hoechst 33258荧光双染、Neuron-specific classⅢβ-Tublin免疫组化染色、CCK-8法和MTT法检测细胞活性及纯度,研究和田羊大脑皮质神经细胞的体外培养特性。结果表明:培养基中加入3μg/mL阿糖胞苷可提高神经细胞纯度,在体外培养至1~8 d的和田羊大脑皮质神经细胞形态和核型均为正常。结果表明成功建立了和田羊大脑皮质神经细胞体外培养模型。     

绵羊TSHR基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系

为了探究绵羊TSHR基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系,本试验采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)研究TSHR基因在常年发情小尾寒羊和季节性发情苏尼特羊的大脑、下丘脑和垂体组织中的表达情况,比较两个绵羊品种的3种组织中TSHR基因的表达差异。同时利用SequenomMassARRAY~(○R)SNP技术检测2组绵羊(常年发情组:小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊;季节性发情组:滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)TSHR基因SNP位点(g.89290286AG和g.89355312GA)的多态性,并与绵羊季节性发情性状进行关联分析。结果表明,无论在小尾寒羊还是苏尼特羊中TSHR基因下丘脑中表达量均极显著高于大脑和垂体(P0.01),且苏尼特羊下丘脑中TSHR基因表达量极显著高于小尾寒羊(P0.01)。绵羊TSHR基因g.89290286AG和g.89355312GA位点均存在AA、GA和GG共3种基因型,其中g.89290286AG位点在小尾寒羊、策勒黑羊和草原型藏羊中表现为中度多态(0.25PIC0.5),在滩羊、湖羊和苏尼特羊中表现为低度多态(PIC0.25),g.89355312GA位点在6个绵羊品种中表现为中度多态(0.25PIC0.5)。TSHR基因上述2个位点的基因型频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间差异均达到极显著水平(P0.01)。综上,TSHR基因的表达可能与绵羊季节性发情有关,其g.89290286AG和g.89355312GA位点与绵羊季节性发情性状可能存在一定关联。     

绵羊GnIH和VIP基因在不同繁殖状态下的表达变化

旨在进一步阐明GnIH和VIP基因在绵羊季节性发情和繁殖调控中的作用。本研究选取短光照(模拟繁殖季节)和长光照(模拟休情期)下成年苏尼特母羊各3只及卵泡期和黄体期的小尾寒羊母羊各3只,同时选取短光照第21天和长光照第3、15、21、42、49天共6个不同光照时间点的成年苏尼特母羊各3只,屠宰后采集其性腺轴组织(下丘脑、垂体、松果体、卵巢、输卵管、子宫体),利用qPCR技术分析GnIH和VIP基因mRNA表达规律。结果表明,GnIH和VIP基因在2个绵羊品种上述各组织中均表达,且在下丘脑中的表达量较高;苏尼特羊下丘脑中2个基因在长光照条件下的表达量均极显著高于短光照条件(P<0.01);在小尾寒羊下丘脑组织中,黄体期VIP基因的表达量显著高于卵泡期(P<0.05),黄体期GnIH基因的表达量稍高于卵泡期,但差异不显著(P>0.05)。由短光照转至长光照时,苏尼特羊下丘脑中GnIH和VIP基因表达上升,至长光照第3天时,2个基因表达均达到峰值,之后呈下降趋势。本研究揭示了GnIH和VIP基因在季节性发情和常年发情成年绵羊性腺轴各组织中的定量表达特征,不同光照条件和不同繁殖时期绵羊下丘脑中这2个基因的表达变化进一步提示了GnIH和VIP基因参与绵羊季节性发情调控和发情时期转换;在短光照转至长光照过程中,GnIH和VIP基因主要在长光照前3 d发挥关键作用。     

绵羊PER3基因组织表达及多态性与季节性繁殖的相关性研究

为了探究PER3基因的组织表达水平及其多态性与绵羊季节性繁殖的关系,为绵羊育种提供理论基础,该试验通过实时荧光定量PCR(qPCR)研究PER3基因在季节性发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中的表达情况,同时利用SequenomMassARRAY~(○R)SNP技术对季节性发情绵羊品种(草原型藏羊、苏尼特羊、滩羊共204只)和常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊共564只)PER3基因的13个SNPs进行分型检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:PER3基因在绵羊的松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中均有表达,且其在季节性繁殖的苏尼特羊的表达均高于常年发情的小尾寒羊(卵巢组织除外),在松果体和子宫组织中达到显著差异水平(P0.05);分型结果表明,在该实验室前期通过重测序得到的PER3基因13个SNPs中,g.43657503AG、g.43670012TC、g.43670807AG、g.43677259TC和g.43707227GA 5个SNPs在季节性发情和常年发情绵羊品种之间的基因型频率、等位基因频率均达到显著差异水平(P0.05);关联分析结果表明,PER3基因的13个SNPs与小尾寒羊产羔数并无显著关联(P0.05)。该研究表明,PER3基因在松果体、下丘脑和垂体等繁殖相关组织的表达,在苏尼特羊中均高于小尾寒羊,暗示着较高水平的PER3的表达可能与绵羊的季节性发情调控有关。     

PER2基因组织表达及多态性与绵羊季节性繁殖的相关性研究

为探究PER2基因在绵羊繁殖相关组织中的表达水平及其多态性与绵羊繁殖性状的关系,本实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测PER2基因在季节性发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中的表达情况,同时利用Sequenom MassARRAY~?SNP技术检测季节性发情绵羊品种(草原型藏羊、苏尼特羊、滩羊共204只)和常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊共564只)PER2基因g.2852655T>C位点的多态性。结果表明:PER2基因在绵羊的松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中均有表达,且在季节性繁殖的苏尼特羊卵巢和子宫组织中的表达均显著高于常年发情小尾寒羊(P<0.05),而在输卵管组织中则相反(P<0.05);分型结果表明,PER2基因的g.2852655T>C位点存在3种基因型,该位点的基因型频率和等位基因频率在发情性状不同的绵羊品种之间具有显著差异。综上,PER2基因在季节性发情苏尼特羊卵巢组织中的表达量显著高于常年发情小尾寒羊,初步推测卵巢中较高水平PER2基因的表达通过抑制LHR受体的表达及孕酮的分泌,进而影响绵羊的季节性发情,且较高水平PER2基因表达可能在卵子受精和胚胎发育过程中也起到重要调控作用。     

孕激素受体在雌性山羊颈前神经节的分布

为研究雌性山羊颈前神经节(SCG)是否具备接受孕激素作用的条件,从而推测孕激素是否参与靶器官内分泌过程的神经调控,本试验采用免疫组织化学SP法研究雌性山羊SCG中孕激素受体(PR)的分布特点。结果显示在雌性山羊的SCG中,PR免疫反应阳性产物广泛分布,在神经元胞体、施万细胞、卫星细胞、神经纤维中均有不同程度的着色。其中神经元均为PR阳性,细胞膜和细胞质呈黄褐色,PR为中等阳性,而细胞核呈棕褐色为强阳性。另外施万细胞、支持细胞和神经纤维中也有淡黄色、弱阳性的PR阳性产物。图像分析表明,神经元胞体PR的相对表达量极显著(P<0.01)高于其他非神经成分。以上结果表明雌性山羊颈前神经节是孕激素作用的主要靶器官之一,提示孕激素可能作用于SCG交感节后神经元,从而参与SCG支配的靶器官的功能活动,而SCG内神经元上的PR有可能作为一个节点协调孕激素对内脏器官的内分泌调节和自主神经对内脏器官的神经调节。     

哺乳动物下丘脑-垂体-卵巢轴的研究进展

哺乳动物的下丘脑、垂体和卵巢分泌的激素在功能上相互作用,构成一个完整的神经内分泌生殖调节体系,即下丘脑垂体卵巢轴,它在生殖活动中起着主要的调节作用。下丘脑中分布的GnRH神经元可以分泌GnRH,GnRH调节垂体中促性腺激素细胞分泌促性腺激素FSH和LH,促性腺激素作用于卵巢受体,引起雌激素和孕酮分泌并影响生殖活动。从组织学角度上研究,下丘脑垂体卵巢轴中的结构,如GnRH神经元、促性腺激素细胞、卵泡随周期性变化而呈现出不同的形态结构和分泌特点。因此,对以上各种细胞的研究是探讨其所分泌激素的基础,而下丘脑垂体卵巢轴中的各种激素的研究则是了解和控制动物繁殖机能的关键。     

绵羊EYA3基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系

为探究绵羊EYA3基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系,本实验通过采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测EYA3基因在常年发情绵羊(小尾寒羊)和季节性发情绵羊(苏尼特羊)的大脑、下丘脑和垂体组织中的表达情况,同时利用Sequenom MassARRAY~?SNP技术检测2组绵羊(常年发情组:小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊;季节性发情组:滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)EYA3基因SNP位点(g.238191128G>C)的多态性,并与绵羊季节性发情性状进行关联分析。结果表明:无论在小尾寒羊还是苏尼特羊,EYA3基因在各组织中均广泛表达,在苏尼特羊垂体中表达较高(P<0.01);且长光照条件下季节性发情的苏尼特羊垂体中EYA3基因表达量显著高于小尾寒羊(P<0.01)。绵羊EYA3基因g.238191128G>C位点均存在GG、GC和CC3种基因型。g.238191128G>C位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊中表现为低度多态(PIC<0.25);在小尾寒羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊5个群体中均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05);并且该位点基因型频率和等位基因频率在常年发情和季节性发情绵羊组间差异均达到极显著水平(P<0.01)。综上,EYA3基因表达与g.238191128G>C位点与绵羊季节性发情性状存在一定关联。     

苦马豆素对新生SD大鼠大脑皮质神经细胞形态学损伤作用的研究

通过建立新生SD大鼠大脑皮质神经细胞原代体外培养模型,采用MTT法测定一个生长周期内神经细胞的活性分布,运用寇氏法计算苦马豆素对大鼠大脑皮质神经细胞的IC50。然后用不同质量浓度苦马豆素染毒12h,倒置相差显微镜观察神经细胞形态并测量其胞体短直径和突起长度的变化。结果显示,一个生长周期内的大鼠大脑皮质神经细胞活力最强为培养第5天,苦马豆素对大鼠大脑皮质神经细胞的IC50为0.851 1g/L。与对照组相比,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少;除0.5g/L试验组外,其他各试验组神经细胞胞体短直径显著减小（P〈0.05）,突起长度显著变短（P〈0.05）,但组间差异不显著（P〉0.05）。结果表明,苦马豆素能明显影响新生大鼠大脑皮质神经细胞的生长发育,苦马豆素作用质量浓度与神经细胞形态改变存在明显剂量-效应关系。