猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光PCR检测方法建立及应用

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属,目前基因型分为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4.但在临床上,PCV2和PCV3流行较多,且鉴于PCV2和PCV3高度相似的临床特征,因此,建立一种快速、可靠的可同时检测PCV2和PCV3的方法,对PCV的临床诊断和流行病学调查意义深远.本研究利用生物信息学软件,设计2对引物和2...     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立一种鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-3)和3型(PCV-3)的方法,本研究根据GenBank中PCV-2、PCV-3基因序列分别设计合成特异性检测引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了鉴别检测PCV-2和PCV-3的双重PCR方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-2/PCV-3混合物可分别扩增出300 bp、518 bp、300 bp和518 bp的特异性条带,检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV均为阴性,对PCV-2/PCV-3混合物的检测灵敏度达2.1 ng DNA,与PCV-2和PCV-3单项PCR方法的符合率均为100%。该方法在检测136份临床病料样品的应用中,PCV-2阳性率达23.53%(32/136),PCV-3阳性率达18.38%(25/136),PCV-2/PCV-3混合感染率达7.35%(10/136),说明青海省部分地区猪群中存在PCV-2、PCV-3的流行,且存在PCV-2和PCV-3的混合感染。表明该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性,可以用于临床病料中PCV-2和PCV-3的快速低含量鉴别检测,将为PCV-2和PCV-3感染的临床鉴别诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法,为我国猪圆环病毒病的综合防控提供技术支持。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速且同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)的方法,本研究根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列,设计了两对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法。该方法可以同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的基因组扩增结果均为阴性。对PCV2和PCV3的最低检出量均为100拷贝/μL。对广西境内100份健康屠宰猪淋巴结样品检测结果显示,单一PCR与双重PCR检测符合率为100%。结果表明,本研究建立了一种简便快捷、反应灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR技术,为临床样品中PCV2和PCV3的快速检测提供了有效的技术支持。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪圆环病毒2型和弓形虫双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳检测条件和灵敏性;进而建立两种病原的双重PCR检测方法,通过对退火温度、灵敏性和特异性进行测试,最终确定该方法的反应体系及条件。结果显示：双重PCR方法对PCV2和弓形虫的最低检出限分别为78.16和29.19 μg/mL;对伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）等均无扩增,特异性良好。利用该方法对来自川渝地区部分猪场的63份临床样本进行检测,并与单一PCR检测结果进行比对,两种方法的符合率为100%。以上结果说明,本试验建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性强、结果可靠、方便经济,可用于PCV2和弓形虫的实验室快速检测。     

猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立一种针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重PCR检测方法.对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌基因组模板进行PCR特异性检测,没有任何非特异性扩增.敏感性试验显示,建立的PCR检测方法能够检测到的PCV2和Mhp模板的最低浓度分别为130和180fg·mL-1.同时用单项PCR和双重PCR对湖北省的各大猪场的174份PRDC样品进行检测,PCV2和Mhp的符合率分别达到100％和98.28％.进一步应用双重PCR调查PCV2和Mhp在不同猪场的感染动态,结果显示有一定比例的仔猪在产房就已经感染PCV2和Mhp,大部分猪是在保育和育肥阶段被感染 ;但是不同猪场表现出不同的感染动态.本试验建立了一种针对PCV2和Mhp的双重PCR检测方法,具有良好的特异性、敏感性,为临床疾病检测和疾病流行态势调查提供了有力的支持.     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据Genbank中PCV2全基因组序列设计了扩增片段大小为262bp的引物P1/P2,建立了检测猪圆环病毒2型PCR方法。引物对P1/P2从PCV2阳性病毒感染基因组中扩增出特异性条带的最低DNA含量为10-9ng/mL(约100个PCV2病毒)。用该方法对陕西和甘肃的103份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有68份样品检测出阳性,阳性率为66%。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)的分子生物学检测方法,试验根据GenBank中PCV-2的序列设计1对特异性引物,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性进行研究;并用该方法对来自红河州规模化猪场的178份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测。结果表明:该法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PCV-2的检测和流行病学调查等;178份临床病料中有83份阳性样品,阳性率为46.6%。     

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及应用

为建立一种用于检测猪圆环病毒3型(PCV3)的PCR方法,本研究针对Gen Bank中PCV3全基因序列在其保守区设计一对特异性引物,并优化反应条件,建立了PCV3的PCR检测方法。结果显示,该PCR方法仅对PCV3检测为阳性,而对其它常见病原的DNA模板均无扩增。对PCV 3的最低检出量为61.9拷贝/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。通过该方法对133份临床样品进行检测,结果显示PCV3阳性率为29%(38/133),表明PCV3在河南地区已有流行。该方法的建立使PCV3的检测更为快速、简便、经济、实用,为PCV3感染的早期诊断提供了有力的技术支持。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立与优化

为了能够同时检测猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)和猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3),试验根据国内报道的PCV-2和PCV-3毒株全基因序列设计6对特异性引物(P3～P8),并构建标准质粒进行引物特异性试验,然后通过优化扩增条件建立检测PCV-2和PCV-3混合感染的双重PCR方法。最后用PCV-2和PCV-3的感染性克隆同时转染PK-15细胞,盲传5代后用建立的双重PCR方法检测细胞培养液中的病毒核酸。结果表明:构建的PCV-2和PCV-3标准质粒浓度分别为290 ng/μL和380 ng/μL,双重PCR方法的最佳引物组合为P3/P6和P4/P8,最佳DNA聚合酶浓度为0.02 U/μL。使用引物组合P3/P6时,扩增得到的目的片段大小分别为308 bp和608 bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为28个;使用引物组合P4/P8时,扩增得到的目的片段大小分别为291 bp和645 bp,最佳退火温度为60℃,最佳循环次数为26个。运用建立好的双重PCR方法评估感染细胞模型,能有效鉴别PCV-2和PCV-3的单一感染和混合感染。说明优化得到的双重PCR检测方法可用于PCV-2和PCV-3的同时检测。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的PCV2的保守序列,设计1对引物,建立了PCV2的PCR检测方法。试验结果表明,该PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为PCV2的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。     

猪2型圆环病毒PCR检测方法的建立及应用

设计1对猪2型圆环病毒ORF2基因的引物,对甘肃地区的断奶仔猪多系统衰竭综合症疑似病例进行了PCR检测,并优化了PCR反应条件,进行了敏感性、特异性及重复性的测定试验,对其扩增序列进行了测序比较。结果表明,PCR扩增获得了预期大小的片断,将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在91.2%以上。对甘肃地区的69份病料的检测结果为感染率59%,表明甘肃地区的感染已经比较严重。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

猪圆环病毒2型(PCV-2)严重制约着养猪业的发展,目前尚无针对该病的有效疫苗和药物。为了加强PCV-2的监控及预防,根据Gen Bank中已发布的PCV-2的序列设计了一对特异性引物,对PCR的反应条件进行优化,构建了PCV-2的PCR检测方法,并进行了特异性检测和敏感性试验,并用该方法对泰州地区67份疑似病料进行了检测。结果表明:建立的PCR方法操作简单,技术要求较低,便于临床检测或流行病学调查,所检测的泰州地区67份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病料(淋巴结),其中42份表现为阳性,阳性率可达62.9%。说明该检测方法的建立有利于规模化猪场对PCV-2的检测及监控,可为该病的早期诊断提供技术平台。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。     

猪捷申病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立可同时检测猪捷申病毒（PTV）与猪圆环病毒2型（PCV2）的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187bp（PTV）、120bp（PCV2）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2．8×10^-2ng和6．6×10^-3ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23％,PCV2阳性率为38％,PTV与PCV2共感染率为16％。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)可引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(PM-WS),还可造成母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、幼龄仔猪的先天性震颤等...     

猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立

为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒Ⅱ型双重PCR检测方法的建立及应用

<正>猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性传染病,病死率高达100%[1],给全球养猪业构成很大威胁[2-3]。猪圆环病毒(Porcine circocirus,PCV)有2种基因型,其中猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circocirus type2,PCV-2)是主要的致病毒株,该病毒可以潜伏感染,引起免疫抑制[4]。PRV和PCV-2均属于DNA病毒,在临床上有很高的感染率,这2种病毒常呈混合感染状态。研究发现,在规模猪场2种病毒的混合感染率达到14%以上[5-8],为了建立一种PRV和