猪圆环病毒2型吉林株的分离与鉴定

利用猪圆环病毒2型(PCV2)特异性引物,对吉林省某猪场发生的具有典型断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状病猪的淋巴结、脾脏组织进行PCR检测。将检测阳性的病料研磨、高心、过滤除菌,接种到无PCV污染的PK-15细胞进行病毒分离。将PK-15细胞增殖所得的病毒纯化后,在电镜下观察到直径约为17 nm的圆形病毒样粒子。PCV2间接免疫荧光试验,可在细胞浆中观察到特异性荧光颗粒。PCV2特异性PCR检测细胞培养物,获得阳性结果。由此说明,分离出的病毒为猪圆环病毒2型。     

猪圆环病毒病Ⅱ型的防治

综述了猪圆环病毒病Ⅱ型的病原、流行病学、临床症状、病理变化,并提出了防制措施,以供养猪生产防治该病参考。     

猪Ⅱ型圆环病毒的研究进展

断奶仔猪多系统衰竭综合症（Post weaning Muhisystemic Wasting Syn-drome,PMWS）是一种以发烧、渐进性消瘦、呼吸和消化紊乱为特征的传染性疾病,Ⅱ型猪圆环病毒（Porcine circovirus type2,PCV2）是的主要病原,有研究表明PCV2病毒的感染打开了其它细菌和病毒性疾病爆发的门户,     

猪圆环病毒2型生物学特性与致病特征研究进展

综合分析猪圆环病毒2型(PCV2)的病原生物学和临床致病特征。PCV2病原生物学研究表明,PCV2在猪的不同生长发育阶段的易感细胞存在差异,可调节单核细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌;PCV2存在2个基因亚型,并在ORF2中存在可区分两型的特异性核苷酸序列,PCV2b型为1486-TcAaacCCCGG,PCV2a型为AcC aacAAAAT;我国PCV2分离株与国外分离株同源性不高,推测PCV2在我国存在的时间也比较长,经过多年的流行,病毒发生了变异。在致病特征研究方面,PCV2与多种病原混合感染导致多系统衰竭、呼吸困难、繁殖障碍并可加重腹泻病毒的毒性。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆与表达

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.笔者用PCR方法扩增PCV2截短的ORF2基因并亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,构建的重组表达质粒命名为pGEX-ORF2,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经IPTG诱导4h.PCV2的cap蛋白以包涵体形式得到有效表达.经SDS-PAGE及Western blot分析表明表达的重组蛋白分子量约为46KD,重组蛋白具有良好的免疫学活性.     

猪圆环病毒Ⅱ型血清抗体ELISA检测方法的建立

为了检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)抗体,本试验建立了快速、敏感的ELISA诊断方法.通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等4种方法纯化PCV2抗原的包被效果,来确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法,在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA稀释倍数的确定、待测血清稀释倍数的确定、封闭液浓度的确定、封闭时间的确定、HRP-SPA反应时间的确定、临界值的确定、特异性测定、重复性测定、符合率比较等,进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法.结果表明:对猪的多种病毒阳性血清进行ELISA检测,只有PCV2阳性血清呈阳性;对6份血清进行4次重复试验,方差分析显示P0.05,差异不显著;与PCV2-ELISA试剂盒(INGEZIM公司生产)的符合率比较,其总符合率达88.89%.可见,优化建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性高、稳定性好,可用于PCV2血清学诊断和血清学普查.     

猪圆环病毒2型（PCV2）的致病机理

猪圆环病毒2型（PCV2）是近年来发现的一种新病毒。该病毒主要侵害哺乳仔猪和育肥猪。PCV2感染可造成猪免疫系统的损伤．引起感染猪的T淋巴细胞、B淋巴细胞数量减少：细胞因子的表达量改变。同时,PCV2感染的靶细胞在胎儿期是心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞,而出生后只有巨噬细胞。因而推测猪感染PCV2后,机体的免疫力下降,感染猪处于亚健康状态．其它病原如猪呼吸与繁殖综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）等,或应激因素如免疫刺激等多种因素都可加重PCV2感染猪的病情．进而发展成临床症状和病理变化较明显的断奶后多系统衰竭综合症、皮炎和肾病综合症等与猪圆环病毒相关的疾病。     

7株猪圆环病毒2型福建分离株全基因组序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,分段设计2对PCV2特异性引物,用PCR方法扩增近年从福建省部分发病猪场分离鉴定的7株PCV2的全基因序列并进行比对分析.结果表明:7株PCV2基因组全长1767 bp,与GenBank上发表的17株PCV2参考毒株的同源性为94.7%-99.5%;7株PCV2分离株之间的全基因同源性高达98.4%-99.5%;7株PCV2 ORF2编码蛋白均具有很强的亲水性和抗原性,其核苷酸及推导的氨基酸同源性高达98.9%-99.7%和97.9%-99.6%,与参考毒株的同源性分别为91.1%-99.7%和85%-100%,存在一定的差异.可见,7株PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异.     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用PCV2病毒免疫8周龄BALB/c雌性小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,原核表达的PCV2病毒Cap蛋白作为检测抗原进行ELISA检测,获得了1株PCV2单抗,命名为2E9。用PCV2全病毒免疫小鼠,能获得特异性针对PCV2病毒的单克隆抗体。为建立特异性强、敏感性高、简便快速的PCV2检测方法打下了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体诊断试剂IgG的研制

应用猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2重组蛋白,研制诊断PCV2的抗体试剂.利用原核表达系统表达PCV2 ORF2蛋白,经12%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分析后免疫家兔制备抗PCV2 ORF2重组蛋白抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(indirect-ELISA)确定其效价,然后以Western blotting法分析该抗体特异性.结果表明:PCV2 ORF2重组蛋白被表达,且在免疫家兔后获得效价高、特异性好的抗体.兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体以其特异性好的特点可以作为免疫诊断试剂.     

一株猪圆环病毒2型的分离与分子鉴定

利用PCR技术初步检测疑似PCV2感染的猪肺脏和淋巴结中的病毒.将样品处理后接种于PK-15细胞.从感染PK-15细胞PCR扩增PCV2基因片段,克隆入pMD18-T载体,并进行序列测定和比较.序列分析结果表明,分离病毒的PCR产物与国内多株PCV2核酸同源性大于98%,说明所分离的病毒为PCV2.     

猪圆环病毒2型标签重组病毒构建和免疫试验

猪圆环病毒2型（PCV2）能引起断奶仔猪衰竭综合症,为了获得利于纯化的病毒和新型标记疫苗,采用病毒重组技术,选择利于纯化的6个氨基酸His标签作为标记表位,插入PCV2 Cap蛋白 C端,拯救获得重组标记病毒rPCV2-His。间接免疫荧光和Western blot鉴定结果证明重组病毒所含的标签能稳定表达。通过镍柱纯化重组病毒,该病毒获得了纯化。纯化的重组病毒灭活后免疫小鼠,PCV2特异抗体显著提升,且能产生标记免疫抗体,小鼠攻毒显著降低体内PCV2含量。该重组病毒可作为PCV2新型疫苗研究重要材料。     

猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用

根据国外已发表的猪环状病毒2型（PCV－2）的全基因组序列，设计一对2型特异性引物，对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD18－T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中，经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定，证明扩增出了PCV－2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV－2序列进行比较，发现同源性均在90％以上。用该PCR方法在43份可疑病料中检测到了12分PCV－2阳性病料，表明该病在我国已有流行。     

猪圆环病毒2型北京株全基因组的克隆与序列分析

为探索近年来北京地区猪圆环病毒2型（PCV2）的流行病学和变异规律,用PCR技术从北京不同猪场的临床发病猪和死亡猪病变组织中分别扩增和克隆获得4株PCV2分离株全基因组序列,并进行测定和分析。结果显示,4株PCV2基因组全长均为1767nt,其核苷酸同源性高达99％,与其他北京分离株的同源性也达98％以上,与国内外其他地区PCV2的核苷酸同源性也在95％以上。由此表明,各个PCV2分离株在进化方面存在地域相关性。     

猪圆环病毒2型江西樟树株的分离与鉴定

对江西省樟树市某猪场疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行PCR扩增检测,将PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2病毒的分离,并将分离纯化的PCV2病毒接种试验猪,获取感染PCV2的试验猪的相关脏器进行荧光定量PCR和免疫组化检测。结果表明:利用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR方法可以确定PCV2的存在。利用荧光定量PCR和免疫组化可以检测到人工感染PCV2的试验猪相关脏器有PCV2病毒的存在。     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF1基因的扩增测序与序列分析

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV-2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3%～100%;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达

[目的]检测猪圆环病毒2型（PCV2）核衣壳蛋白（Cap）的表达,为进一步研制PCV2单克隆抗体检测抗原提供参考依据。[方法]根据已经发表的PCV2的衣壳蛋白基因（Cap）设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到1条DNA片段。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达载体质粒pET28a（＋）中,获得重组质粒pCAP-PCV2,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。[结果]序列测定表明,所克隆的序列大小为579 bp,与DQ104422的Cap基因序列一致;通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析证明,携带重组质粒pET-PCV2-Cap的大肠杆菌可以表达可溶性的衣壳蛋白。[结论]PCV2衣壳蛋白能通过表达载体质粒pET28a（＋）进行可溶性表达。     

猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合感染对仔猪致病性的研究

对35日龄健康仔猪进行人工单独或混合感染猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2),采用临床症状、组织病理学变化和血清学检测等手段,比较了不同实验组攻毒后仔猪的症状差异。实验结果显示:PPV和PCV2混合感染能够引起更加严重的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状,并加重PCV2引起的间质性肺炎和仔猪消瘦的严重程度;混合感染后,仔猪病毒血症出现更早,持续时间更长,且病毒含量明显高于单独感染组;混合感染组仔猪的PCV2 ELISA抗体水平和血清抗体水平均显著高于PCV2单独感染组的。说明PPV能够明显增强PCV2的临床症状,加重PMWS的发病程度。     

猪圆环病毒2型感染后猪血液学指标研究

为观察PCV2感染猪对其血常规及生化指标变化的影响,将6头PCV2抗体阴性的21日龄断奶仔猪随机分成攻毒组和对照组,攻毒组经颈部肌肉及口鼻分别接种PCV2-BH毒株,攻毒后检测部分血常规指标、免疫球蛋白质量浓度及部分血清生化指标。结果显示,感染后第4天和第7天,白细胞总数分别是正常生理水平的74.2%、79.9%;感染后第7天,淋巴细胞百分比是正常生理水平的35.05%,差异达显著水平(P<0.05),单核细胞和中性粒细胞百分比均显著低于对照组,说明PCV2感染降低了机体的先天免疫机能,增加了继发感染的几率,同时还说明PCV2-BH株具有较好的抗原性;攻毒组血清全部转阳,说明PCV2-BH毒株具有较好的免疫原性,可作为开发PCV2疫苗的候选毒株。