细粒棘球蚴TP_x蛋白的分子特征与反应原性

为明确绵羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TP_x)蛋白的反应原性,并进一步利用Eg TP_x重组蛋白作为Eg感染诊断中的候选标识分子奠定基础,根据GenBank中Eg TP_x基因的cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节为总RNA模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,经测序验证后亚克隆至表达载体pET-32a中,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及反应原性分析。结果表明:Eg TP_x cDNA全长为582个核苷酸,编码193个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个N端酰基化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位点,4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;抗原表位区集中在58~94位和160~188位。重组菌可表达分子量为37ku的重组蛋白,重组蛋白Eg TP_x抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

新疆棘球蚴Eg95基因的克隆与序列分析

从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组DNA,以细粒棘球蚴原头节DNA为模板,用Eg95特异性引物进行PCR扩增,获得Eg95-XJ-1基因,并将其克隆至pGM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后,发现新疆株Eg95-XJ-1基因片段为1 304 bp。与Gene Bank中已知的Eg95基因有86%~99%的同源性,其差异大都集中在内含子区;与青海株Eg95基因家族成员同源性最高达97%~99%。这些结果表明,这一新疆地区的Eg95-XJ-1基因为Eg95基因家族成员之一。     

细粒棘球蚴病的诊断与防治

对细粒棘球蚴病的诊断与防治进行了综述,以期为该病的进一步研究提供参考。     

细粒棘球绦虫表膜糖抗原HSP70基因的克隆、表达及免疫特性分析

[目的]克隆细粒棘球绦虫(Eg)表膜糖抗原的热休克蛋白70 (HSP70)基因,构建原核表达载体,鉴定EgHSP70蛋白的免疫学特性.[方法]以Eg表膜糖抗原高免鼠血清为探针,从Eg成虫cDNA文库中筛选得到阳性克隆EgHSP70.构建EgHSP70基因的原核表达载体pET28a-EgHSP70,诱导表达重组蛋白,纯化,免疫鼠,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测血清抗体效价、特异性及抗原在虫体组织中的位置.[结果]从Eg成虫cDNA文库中筛选获得特异性EgHSP70基因,酶切和测序结果均表明该基因已克隆到pET28a.EgHSP70融合蛋白在A600=0.6,0.4 mmol IPTG,37℃表达5h为最佳表达.经His亲和层析法纯化获得了HSP70融合蛋白相对分子质量约为33 kDa.免疫小鼠可产生高滴度(最高1∶640000)特异性抗体.Westernblot分析结果表明,制备的抗血清与EgHSP70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、Eg虫体蛋白和Eg虫体表面蛋白均能特异性结合,其他带科绦虫有此蛋白表达IFA检测结果证实EgHSP70在细粒棘球绦虫成虫体表膜及体表内有表达.[结论]实验得到的EgHSP70融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性,可用于研制包虫病疫苗及相关诊断试剂为包虫病的防控提供技术支持.     

细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

【目的】克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4,RTN4)抗原基因,对其序列进行生物信息学分析。【方法】采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏,提取Eg头节总RNA为模板,对RTN4基因进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】Eg RTN4cDNA全长654bp,编码217个氨基酸,蛋白质分子质量为25.3ku,等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测,RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域;含有2个高度疏水区,2个跨膜区,膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】成功克隆了Eg RTN4基因,预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。     

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。     

细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析

旨在分析并预测细粒棘球绦虫锌指蛋白(Echinococcus granulosus zinc finger peotein,Eg-ZFP)结构、功能及其在细粒棘球绦虫发育过程中的表达模式,预测其在细粒棘球绦虫防治中潜在的作用。通过对前期细粒棘球绦虫原头蚴(protoscolex,PSC)转录组高通量测序结果中Unigene进行筛选,克隆Eg-ZFP基因并进行序列分析,实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)分析Eg-ZFP在原头蚴及成虫中的表达特征,利用全量组织原位杂交(Whole mount in situ hybridization,WISH)检测该蛋白mRNA在原头蚴和成虫组织中的分布情况。结果显示,细粒棘球绦虫Eg-ZFP基因的CDS序列长852bp,具有完整的开放阅读框(852bp),编码283个氨基酸,预测表明Eg-ZFP分子质量大小及等电点为31.6ku和8.89;qPCR检测发现,Eg-ZFP在原头蚴及成虫阶段均有表达,且在成虫阶段表达量高;全量组织原位杂交检测结果表明,Eg-ZFP mRNA在原头蚴及成虫中分布广泛,且在成虫的生殖系统中丰度较高,提示Eg-ZFP与虫体生殖发育有关。结果表明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫发育过程中具有重要作用,为进一步研究Eg-ZFP在E.granulosus防治中的作用奠定基础。     

羊细粒棘球蚴全血金标渗滤检测方法的建立

为建立一种快速、高效的诊断家畜细粒棘球蚴病方法,提取羊细粒棘球蚴包囊的新鲜囊液,盐析囊液抗原,点样于硝酸纤维膜上,以胶体金-驴抗羊IgG和胶体金-兔抗鼠IgG为检测标记物,采用垂直流渗滤装置检测羊与人工感染细粒棘球蚴小鼠的血清和全血特异性抗体.患病羊阳性血清及全血检出率在90.91％ ～94.4％,细粒棘球蚴感染小鼠的血清及全血检出率均为100％;细粒棘球蚴阴性羊血清和全血假阳性率为4.00％～4.59％;与脑多头蚴病血清交叉反应率为28.57％(2/7).研究结果表明,细粒棘球蚴全血金标渗滤法可应用于羊棘球蚴病的诊断与检疫.     

绵羊肺炎支原体膜蛋白p74基因的克隆、分子特征及反应原性研究

【方法】利用PCR方法对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)新疆分离株MO-XJ p74基因进行扩增、克隆及测序,分析其分子特征。将P74蛋白抗原集中区编码序列亚克隆至表达载体p ET-32a(+),构建重组表达载体p ET-32a(+)-p74C,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达。【结果】MO-XJ p74基因全长2016 bp,编码671个氨基酸;对编码的氨基酸序列分析发现,该蛋白不含信号肽序列,9~31位氨基酸序列含有1个跨膜区,有16个N-糖基化位点、7个N-酰基化位点、17个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点及5个蛋白激酶C磷酸化位点。同源性分析显示MO-XJ P74蛋白氨基酸序列与标准株MO-SC01氨基酸序列同源率为86.5%,其羧基端为P74蛋白抗原集中区。SDS-PAGE检测结果显示,表达的P74蛋白抗原表位集中区片段对分子质量约为35.5 k Da,与理论值相符;Western blot分析表明重组P74蛋白具有较强的反应原性。【结论】本研究为进一步筛选MO亚单位疫苗及血清学诊断的候选抗原奠定了前期基础。     

阿拉善右旗骆驼、羊棘球蚴病的调查

骆驼、羊的棘球蚴病（称：包虫病）是细粒棘球绦虫（Ecinococous,granulosus）的幼虫,寄生于绵羊、山羊、牛、骆驼、猪等中间宿主的肺、肝、脾等脏器而引起的一种慢性寄生虫病。在其流行区域内人也易感染,对我旗人体健康和畜牧业生产的发展造成了严重的危害。     

棘球蚴病流行病学、诊断及防控的研究现状

棘球蚴病又称包虫病,是由棘球绦虫属的幼虫引起的人畜共患病。在我国,西部是囊性（CE）和肺泡（AE）型棘球蚴病的最高流行地区。这种严重且近乎世界性的疾病,不仅带来了重大公共卫生问题,还给畜牧业造成巨大经济损失。该文对该病的传播、流行病学、诊断以及防控现状进行了论述,旨在为棘球蚴病防治提供科学的参考依据。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

大豆HSP20基因的鉴定及表达分析

HSP20是一种小分子热激蛋白,在植物生长发育和抗胁迫过程中发挥重要作用.研究利用生物信息学方法对大豆中56个GmHSP20家族基因进行了鉴定,并对其理化性质、基因结构、进化关系、启动子原件以及表达模式进行了分析.56个家族基因分为11个亚族,分布在18条染色体上;氨基酸长度不一、分子量和等电点变化范围比较大;启动子原...     

梅迪-维斯纳病毒gag蛋白的原核表达及其交叉反应原性

为鉴定适用于中国小反刍动物慢病毒(Small ruminants lentivirus viruses,SRLVs)血清学诊断的通用蛋白标记物,本研究以梅迪-维斯纳病毒(Maedi-Visna virus,MVV)四川株为模板扩增获得gag基因序列,使用生物信息学方法分析其与中国山羊关节炎-脑炎病毒(Caprine arthritis encephalitis virus,CAEV)分离株gag蛋白氨基酸序列和抗原表位相似性,构建gag基因重组表达载体并转入BL21(DE3)宿主菌进行诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting确定其大小、分布和反应原性。结果显示,MVV gag蛋白氨基酸序列与中国CAEV分离株的相似性为74.7%～74.9%,它的11个抗原表位与CAEV gag蛋白的12个抗原表位存在较高的序列相似性,推测其可作为中国SRLVs血清学诊断的通用蛋白质标记物;SDS-PAGE检测结果显示,重组gag蛋白大小约为55 000,主要以包涵体形式存在,Western blotting显示该蛋白可与MVV和CAEV感染动物血清发生免疫反应,证实了蛋白序列分析结果。该研究结果可为研制中国SRLVs通用血清学检测技术方法奠定基础。     

绵羊肺炎支原体膜蛋白p56基因的克隆、表达及反应原性研究

为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG对重组菌进行诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果表明,SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为44 kDa;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组p56融合蛋白具有良好的反应原性,为进一步研发MO检测用抗原奠定了前期基础。     

狂犬病病毒G蛋白的原核表达及反应原性分析

为优化狂犬病病毒G蛋白的原核表达条件,探究其反应原性,参照狂犬病病毒CTN-1V10株编码G蛋白基因序列,采用生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段,并将该片段命名为G5F。将该片段与pET-28a原核表达载体连接,构建重组表达质粒pET-G5F,并将重组质粒进行诱导表达,在IPTG浓度为0.2 mmol/L、温度为20℃、诱导12 h时,重组蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳及Western blot分析表明,G5F重组蛋白可溶性表达量高,且可以被抗狂犬病病毒单克隆抗体识别,反应原性良好。     

肉鸡CMTR2基因分子特征及其表达谱分析

[目的]分析肉鸡加帽甲基转移酶基因(CMTR2)分子特征及其表达谱,为后续开展鸡CMTR2基因结构及生物学功能研究打下基础.[方法]以艾拔益加(AA)肉鸡为研究对象,利用RT-PCR克隆CMTR2基因,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM 2.0和SignalP 3.0等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测分析其表达特征.[结果]肉鸡CMTR2基因编码区(CDS)序列全长为2350 bp(登录号MN296490),其开放阅读框(ORF)为2292 bp,编码763个氨基酸残基;肉鸡CMTR2氨基酸序列与原鸡CMTR2氨基酸序列的相似性为99.74%,只有2个氨基酸残基差异,与火鸡CMTR2氨基酸序列的亲缘关系较近(相似性为95.94%).肉鸡CMTR2蛋白分子量为86855.48 Da,理论等电点(pI)为6.08,在哺乳动物网织红细胞体外表达的半衰期为30 h,在酵母体内表达的半衰期大于20 h,在大肠杆菌体内表达的半衰期大于10 h.肉鸡CMTR2蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域,包含61个磷酸化位点、15个二硫键、1个N-糖基化位点及8个O-糖基化位点;其二级结构由α-螺旋(49.93%)、无规则卷曲(35.65%)、延伸链(11.53%)和β-转角(2.88%)组成,但无法获得完整的三级结构.CMTR2基因在42日龄AA肉鸡8种组织中的相对表达量排序为脾脏>肺脏>胸肌>腹脂>肝脏>肾脏>腿肌>心脏,以在脾脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同);肉鸡CMTR2基因的时空表达变化趋势表现为21日龄的相对表达量最高、14日龄的相对表达量最低.[结论]CMTR2基因在不同物种中具有较高的保守性,因其在肉鸡脾脏中的表达水平最高,故推测CMTR2基因是参与机体免疫相关的关键基因.     

枣CML基因的分子特征及其抗寒性表达模式分析

【目的】探究枣类钙调蛋白（ZjCML）在抗寒性中的重要作用,旨在挖掘关键抗寒ZjCML基因,为进一步利用其进行枣抗寒育种提供理论参考。【方法】本研究利用生物信息学技术,全面分析了枣CML基因家族成员的数目及相关结构特征,并利用RNA-seq和实时荧光定量PCR技术分析其响应低温胁迫时的表达模式,为筛选关键抗寒基因奠定基础。【结果】在枣基因组数据中共鉴定到23个ZjCML基因,不均匀地分布在12条染色体上。与拟南芥CMLs蛋白构建进化树分析发现ZjCMLs可被分为12个类群。蛋白网络互作预测发现16个ZjCMLs存在于该网络中,且具有一定的互作关系。RNA-seq结果表明ZjCML13和ZjCML6基因表达模式在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫中具有显著差异,其中ZjCML13在‘冬枣’响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达,而在‘冬枣’同源四倍体中表达差异不显著。外源Ca Cl2和褪黑素处理后,ZjCML13在‘冬枣’同源四倍体响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达,说明其可能通过诱导ZjCML13表达调控‘冬枣’同源四倍体抗寒性。【结论】枣CML基因家族具有特定的结构特征及响应...     

花绒寄甲HSP70基因的特征与表达

为阐明热休克蛋白70(HSP70)在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)发育及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析了其在发育阶段和环境胁迫时的表达情况。从花绒寄甲转录组中获得3条HSP70基因,分别命名为D.h HSP69.09、D.h HSP70.11和D.h HSP71.88。发育阶段定量结果显示,3条HSP70在所有发育阶段均有表达,D.h HSP69.09在1龄幼虫期表达量最高;D.h HSP70.11和D.h HSP71.88在雄虫中表达量最高。在检测的成虫组织中,D.h HSP69.09和D.h HSP70.11在卵巢表达量最高;D.h HSP71.88在脂肪体中表达量最高。HSP70基因随温度升高(23℃升至44℃)、41℃下处理时间(0~270 min)延长、氧化剂浓度(0~70 mmol·L-1)的升高表达量先增加后减少,雌雄表达量差异较大。饥饿试验显示,雌雄虫表达模式不同;随饥饿时间延长,雄虫HSP70基因表达量有所降低,雌虫一定时间内有所上升。因此,花绒寄甲HSP70可能与不同发育期的转换、幼虫的蜕皮行为相关;HSP70对温度、氧化和饥饿胁迫的应激敏感程度和表达水平不同,能够有效应对高温、氧化、饥饿等环境胁迫。     

核糖体蛋白基因协同表达的分子机制

从真核生物核糖体蛋白的基因结构和所涉及的信号传导途径入手,论述了核糖体蛋白基因协同表达的分子机制。