双重实时荧光PCR快速检测猪链球菌2型方法的建立及应用

根据GenBank上公布的MRP与CPS2J的开放性阅读框保守序列,运用BEACON Desigener 2.0软件设计和合成了2对引物和其相应的荧光探针,优化各个反应物的浓度和实时荧光PCR循环程序,建立从组织中直接检测2型链球菌主要毒力因子MRP与CPS2J的实时荧光PCR方法.双重实时荧光PCR检测2型猪链球菌方法能够从病料中直接检测2型猪链球菌并可以检测出该菌的主要毒力基因MRP,运用该方法可以最低检测到24CFU/mL 2型猪链球菌,并且与其他血清型链球菌和其他病原菌无交叉反应.特异性良好.通过对8个样品在3个不同时间的检测.结果显示该方法的稳定性和重复性均很好.     

猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

试验根据猪链球菌2型荚膜多糖（CPS）抗原设计CPS2J基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×10¹拷贝/μL,是普通PCR的10倍;特异性试验显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌;重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规PCR方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。     

炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,所建立方法特异性强,与蜡样芽胞杆菌群中其他芽胞杆菌无交叉反应;对BA5345基因和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL~(-1),标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对35份污染皮毛样品检测显示BA5345基因和PA基因的检出率分别为80.0%和82.9%,与常规PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为炭疽杆菌的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

荧光实时定量PCR方法检测猪链球菌2型

以猪链球菌2型的荚膜多糖抗原编码基因cps2J为靶基因设计引物,利用SYBR GreenⅠ能特异地与双链DNA结合发出荧光的特性,以ABI7000为平台,建立荧光实时定量PCR检测猪链球菌2型的方法。该方法检测猪链球菌2型参考株和猪链球菌2型国内分离株都呈阳性,具有良好的特异性。整个检测过程于2h内完成,检测限度为24CFU,标准曲线的相关系数为0.997。对5份采集于猪链球菌2型病猪的病料进行检测,结果表明肝脏和脾脏最适于检测。     

猪链球菌2型LUX荧光PCR检测方法的建立

猪链球菌2型是一种严重的人兽共患病病原,为满足猪链球菌2型快速检测的需要,本研究根据猪链球菌2型Cps2J保守区设计LUX引物,首次利用LUX PCR方法对猪链球菌2型进行检测,并进行了敏感性和特异性试验及模拟样品检测试验。结果显示,本研究建立的猪链球菌LUX 荧光PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,检测质粒样品的敏感性为10拷贝,检测模拟样品敏感性为10²拷贝,与无乳链球菌、巴氏杆菌、粪链球菌、马链球菌兽疫亚种、沙门氏菌等无交叉反应。该方法的建立为猪链球菌2型的快速检测提供了新的途径。     

猪链球菌通用及2型TaqMan荧光PCR检测技术建立与应用

在对设计合成的引物和6-carboxy-fluorescein(6-FAM)荧光素标记的TaqMan水解探针进行筛选的基础上,通过反应体系优化,建立了检测猪链球菌通用和2型的2种荧光PCR检测技术,实现了对猪链球菌的快速检测和定型。敏感性、特异性、重复性、感染组织模拟试验及临床样品的检测结果均表明建立的方法快速、特异、灵敏,整个检测过程(包括样品的前处理时间)可在1.5 h内完成,检测培养物和模拟组织样品的灵敏度可达10 CFU～100 CFU。     

猪链球菌荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用

为快速诊断和检测猪链球菌病,根据GenBank中已登录的猪链球菌抗原基因保守区域序列,设计并合成特异性引物及Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应体系及扩增条件,构建了快速、准确检测猪链球菌的Taqman荧光定量PCR检测方法(Taqman FQ-PCR),测定了该方法的灵敏性、重复性和特异性,并对疑似猪链球菌临床感染样本进行了检测。结果显示:所建立的Taqman FQ-PCR方法检测灵敏度为1×10~2拷贝/μL;对3种不同浓度的猪链球菌重组质粒进行3次重复扩增,变异系数均小于3%,说明重复性好;特异性检测显示,只有猪链球菌样本的扩增曲线呈阳性反应,其他致病菌均无荧光信号;采用此方法,对30份临床疑似猪链球菌感染样本进行检测,发现有27份样本为阳性,比采用国标法检测得到的结果更加灵敏。结果表明,建立的FQPCR方法具有灵敏性高、重复性好、特异性强等特点,可用于猪链球菌的快速诊断和检测。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

猪链球菌2型的PCR快速检测

根据猪链球菌 2型的荚膜多糖抗原基因 cps2 J,合成 1对可扩增长度为 6 75 bp目的片段的引物 ,建立了检测猪链球菌 2型的 PCR法。应用 PCR对 9株经玻片凝集试验检测为猪链球菌 2型的菌株进行了检测 ,均呈阳性 ;而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等检测结果均呈阴性 ,表明了本方法的特异性。用此法对 88份正常猪的扁桃体样品的细菌分离物进行了检测 ,36份呈阳性 ,同时用玻片凝集试验进行对照检测 ,也全部呈阳性。而此法不需进行细菌的纯分离培养 ,即可用于猪链球菌 2型的快速诊断以及流行病学调查。     

应用荧光PCR方法检测猪链球菌2型

应用荧光PCR方法，对东莞市12个屠宰场份的120猪内脏和11个冻肉库的110份冻肉进行了猪链球2型检测，结果均为阴性。并随机从样品中选出22份样品进行了细菌分离鉴定，均未分离出猪链球菌2型。结果表明猪链球菌2型荧光PCR检测方法与传统的细菌分离鉴定方法一致，猪链球菌2型荧光PCR检测方法适合大规模动物产品的检测。     

猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪链球菌2型三种毒力因子CP2SJ、MRP、EF基因序列,利用Primer Express 3.0软件分别设计3对特异性的引物及相应的Taqman探针。CP2SJ、MRP、EF探针5′端分别标记FAM、HEX、CY5荧光发射基团,3′端标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的三重荧光定量PCR,可同时检测上述三种毒力基因。该方法灵敏度高,CP2SJ、MRP、EF的最低检测限分别为90、40、60拷贝数/μL的质粒;特异性强,与其他病原菌无交叉反应;重复性好,变异系数均小于3%。整个检测扩增在60 min内完成。以上结果表明本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型三种毒力因子。     

副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。     

猪PRRSV和PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为快速及定量的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2),本研究根据GenBank中登录的PRRSV和PCV2基因组确定了其基因保守序列,分别设计其特异性探针和引物,建立了PRRSV-PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验显示该方法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒及猪瘟病毒的检测结果均为阴性。对PRRSV和PCV2的检测灵敏度均达10拷贝/μl。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于4%。应用该方法对60份已知临床病料进行检测,结果检出PRRSV和PCV2阳性感染率分别为30.67%和35%,混合感染率为11.67%,与已知结果的符合率为100%。该方法具有敏感、快速、特异、定量、重复性、稳定性好等优点,在用于PRRSV和PCV2感染的快速鉴别诊断的同时,在细胞培养特性以及疫苗生产检测中也具有广阔的应用前景。     

猪链球菌2型毒力因子多重荧光PCR检测方法的建立与应用

本研究通过在扁桃体组织中添加猪链球菌2型菌后提取的DNA为模板，建立了检测猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR检测方法，并对部分猪扁桃体和肌肉组织进行了检测。结果发现，本方法可以快速检测出组织内的致病性猪链球菌2型，且特异性强，灵敏度达到100CFU。采用本研究建立的方法对北京和江西部分屠宰场猪扁桃体及北京市售猪肉进行检测，没有发现致病性猪链球菌2型感染。本检测方法的建立，有利于快速确定人-猪链球菌感染原的致病性，这为疫情发生后，有针对性地采取紧急防控措施、保护消费者的健康和生命安全奠定了基础。     

猪链球菌荧光PCR快速检测方法研制成功

由北京检验检疫局和中国兽医药品监察所研制成功的猪链球菌荧光 PCR 检测技术, 具有快速、敏感、特异、安全等显著特点,此检测技术将传统的细菌分离方法的3～7天检测时间缩短为1．5个小时。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光PCR检测方法建立及应用

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属,目前基因型分为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4.但在临床上,PCV2和PCV3流行较多,且鉴于PCV2和PCV3高度相似的临床特征,因此,建立一种快速、可靠的可同时检测PCV2和PCV3的方法,对PCV的临床诊断和流行病学调查意义深远.本研究利用生物信息学软件,设计2对引物和2...     

多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用

建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌（Streptococcus suis）的多重荧光PCR（multiplex real-time polymerase chain reaction）方法。首先，从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp，用PrimerExpress2．0设计引物和Taqman荧光探针，在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性；检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量，整个过程仅需60min；稳定性试验表明，2次检测所得的ct值之间无统计学差异（P〉0．05）。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强，灵敏度高，稳定性好，适合于大批量样品的检验，可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

2型鲤疱疹病毒双重PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速检测2型鲤疱疹病毒(CyHV-2)的方法,本研究针对CyHV-2三联体蛋白基因的两段保守序列设计特异性引物,建立了CyHV-2双重PCR检测方法,并对反应条件进行优化,扩增的目的片段分别为218 bp和369 bp。特异性试验显示仅CyHV-2扩增出特异性片段,其它病毒均呈阴性;灵敏性试验表明该方法最低可以检测到3×102拷贝/μL的病毒量。对2012年~2013年采集自江苏、湖北、江西、宁夏等地的鲫鱼(Carassius auratus)样品进行检测,结果表明,该方法检测样品的阳性率为87%。以上结果表明建立的双重PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可以用于CyHV-2的快速检测和病原流行病学调查。     

霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立霍乱弧菌(VC)的快速检测方法,以VC的hlyA基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针建立实时荧光定量PCR快速检测法,同时对该方法进行了特异性、灵敏性、稳定性和重复性试验,并对145份临床样品进行了检测。结果表明:特异性试验中15株试验菌株荧光定量PCR检测只有VC菌株为阳性,表明该检测方法特异性强;灵敏性试验表明该方法的灵敏度为25 cfu/m L;稳定性和重复性试验表明同一样品重复检测4次,Ct值的变异系数均小于2%;对145份临床样品进行检测,共计检出2份VC阳性样品,与行标法(SN/T 2425—2010)检测结果一致。说明该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。