猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制

采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,用猪瘟(CSF)抗体标记纯化,并包被在玻璃纤维膜上,另外将纯化的CSF抗体和羊抗鼠抗体包被在硝酸纤维膜上,组装成CSF快速检测条,对猪瘟病毒进行检测.结果表明:使用所研制的CSF快速检测条检测收集的70份待检样品,共检出猪瘟阳性病例26例,而经病毒分离鉴定阳性病例有28例,阳性符合率达92.8%;将5份阳性猪瘟病毒稀释后用试纸条和ELISA方法进行敏感性实验,结果表明,诊断试纸条的敏感性较高,用试纸条对鸽新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒进行检测,无交叉反应.     

香菇多糖对猪瘟疫苗免疫效果的影响

【目的】为了进一步提高猪瘟疫苗的免疫效果,探讨香菇多糖对猪瘟疫苗的免疫增强作用,为新型猪瘟疫苗免疫增强剂的研发提供理论依据。【方法】以不同剂量的香菇多糖作为猪瘟疫苗的稀释液免疫断奶仔猪,分别于免疫当天、免疫接种后第7、14、21、28d无菌操作采集血样,运用ELISA检测血清猪瘟抗体水平。【结果】香菇多糖可显著提高血清中的猪瘟抗体水平,第4组(0.1875mg香菇多糖)于免疫后14d和28d,猪瘟抗体阻断率平均值分别比猪瘟疫苗专用稀释液稀释组提高13.6%和12.2%;免疫合格率为100%。【结论】实验结果表明,将香菇多糖作为猪瘟疫苗稀释液稀释,可特异性提高猪体的免疫应答,香菇多糖具有显著增强猪瘟疫苗免疫效果的作用。     

以二抗为基底猪瘟抗体ELISA检测方法建立

为验证以鼠抗猪IgG为基底,用辣根过氧化物酶标记猪瘟E2蛋白,建立的猪瘟抗体ELISA检测方法的可行性,对影响ELISA试验结果的主要条件进行优化。结果表明,鼠抗猪IgG最佳包被浓度为1μg/ml,酶标猪瘟E2蛋白最佳稀释度为1:500,最佳封闭液为1%BSA。建立的方法对猪蓝耳病阳性血清、猪圆环病阳性血清、猪亚洲1型口蹄疫阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清均无交叉反应。通过对50份试验样本的检测,对比该方法与商品化IDEXX的猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性,试验结果表明,该方法检测猪瘟抗体的相对敏感性为76.9%(30/39),相对特异性为90%(45/50)。     

基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原，辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗，经一系列试验，确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1，血清的最佳稀释度为1∶100，血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST，兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明，阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体；与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应；批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%；100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好，可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。     

用重组HN蛋白建立新城疫抗体检测的ELISA方法

用T4噬菌体表达的重组新城疫病毒HN蛋白(rHN)为包被抗原,建立新城疫抗体检测的酶联免疫吸附实验(rHN-ELISA).结果表明,抗原最适包被浓度为1.6μg/100μL,待检血清最适稀释度为1:80,鸡血清样品的光吸收值OD450大于0.126可判定为阳性结果,而SPF鸡血清,非免疫鸡血清以及MD,IBD,IB,ILT,AI阳性血清的检测结果均为阴性.对批内和批间样品重复检测的变异系数分别为3.7%～8.5%和3.1%～7.4%.人工感染NDV的SPF鸡第3 d即可用rHN-ELISA检测到抗体,灵敏度明显高于HI和AGP试验.因此,rHN-ELISA是1种特异、敏感、快速的ND抗体检测方法.     

用重组HN蛋白建立新城疫抗体检测的ELISA方法

用T4噬菌体表达的重组新城疫病毒HN蛋白（rHN）为包被抗原,建立新城疫抗体检测的酶联免疫吸附实验（rHN-ELISA）.结果表明,抗原最适包被浓度为1.6μg/100μL,待检血清最适稀释度为1：80,鸡血清样品的光吸收值OD450大于0.126可判定为阳性结果,而SPF鸡血清,非免疫鸡血清以及MD,IBD,IB,ILT,AI阳性血清的检测结果均为阴性.对批内和批间样品重复检测的变异系数分别为3.7%～8.5%和3.1%～7.4%.人工感染NDV的SPF鸡第3 d即可用rHN-ELISA检测到抗体,灵敏度明显高于HI和AGP试验.因此,rHN-ELISA是1种特异、敏感、快速的ND抗体检测方法.     

猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用

根据猪瘟病毒5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关系,且重复性好,批间变异系数小于1%。用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒,结果均为阴性。用该方法检测采集自江苏和新疆的192份组织和血清样品,猪瘟病毒阳性率为71.9%;检测感染猪的不同脏器,发现在心、肺、肝、肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可以检测到猪瘟病毒,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高。该方法的建立为猪瘟病毒的流行病学调查和定量提供了有效手段。     

非洲猪瘟病毒无标签p35蛋白的制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了进一步提高非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测方法的特异性,本研究构建了类弹性蛋白(ELP)标签与ASFV p35融合表达载体,利用相变循环分离纯化融合蛋白后,用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVP)切除ELP标签,制备获得无标签p35蛋白,以此为包被抗原,通过一系列的条件摸索和优化,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,ELP-p35融合蛋白的相对分子质量大小约为80 000;制备获得的无标签p35蛋白能够被非洲猪瘟阳性血清所识别;抗原包被最佳质量浓度为2.00μg/ml,待检血清最佳稀释比例为1∶200,二抗最佳稀释比例为1∶10 000,阴性和阳性判定阈值OD₄₅₀为0.171;与口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病毒(PRV)等阳性血清无交叉反应,特异性好;批内、批间试验结果显示变异系数都小于5.000%,重复性好;可检测400倍稀释的血清,敏感性较高;与商品化检测试剂盒(ING)检测结果的符合率高达100%。结果表明,用本研究制备的A...     

猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(CSFV)结构蛋白E0和C为抗原,建立检测血清抗体的间接ELISA方法,评价其敏感性和特异性,并检测疫苗免疫过程中抗E0和C蛋白抗体的消长规律。结果显示:CSFV-E0和CSFV-C间接ELISA抗体检测方法的抗原最佳包被质量浓度分别为2.09和1.59μg/mL,待检血清样本最适稀释度分别为1∶60和1∶80,酶标二抗稀释度分别为1∶100和1∶350,2种ELISA方法与常见猪病原的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。CSF疫苗免疫后第7天即可检测到抗E2、E0和C蛋白的抗体,其中抗E2和E0的抗体在免疫后第21天达到最高水平,E2抗体滴度先上升后下降,E0抗体在免疫后第21天开始下降并最终趋于稳定;C蛋白抗体在免疫后第7天出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。结果表明,利用重组抗原建立的CSFV血清抗体ELISA检测方法,可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点,从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。     

北票市猪瘟流行病学调查报告

正由于辽宁省北票地区是养猪业密集地区,而猪瘟是最重要的猪传染病之一,对其进行有效的综合防制显得非常重要。本试验应用ELISA对北票地区猪血清样品中的猪瘟病毒抗体进行检测,以便对猪群抗猪瘟病毒的免疫力进行评定和监测。应用荧光RTPCR对猪血清样品中的猪瘟病毒RNA进行检测,以便对猪瘟的流行病学进行系统性调查,为制定科学合理的猪     

猪瘟病毒结构蛋白E0抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5 000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD_(450)0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%～7.69%和2.16%～9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。     

酶联免疫吸附试验检测禽脑脊髓炎抗体方法的研究

利用鸡胚成纤维细胞 (CEF)繁育禽脑脊髓炎病毒 (AEV) ,取其培养物 ,经差速离心提纯 ,做为酶联包被杭原 ,建立了检测AEV抗体的间接酶联免疫吸附试验 ,初步确定了各种反应条件 :抗原包被浓度 16 7μg/ml,待检血清 1∶10 0稀释 ,酶标抗体工作浓度 1∶5 0 0。以阴性血清OD值平均值加上 2个标准差作为界值 ,当待测样品OD值大于界值 0 2 7时 ,判为阳性 ,否则判为阴性。经交叉试验、阻断试验、重复试验和平行试验 ,证实了本试验建立的方法具有良好的特异性和重复性     

PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法的建立

用亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400 ng,待检血清最佳稀释度为1∶100,待检血清样品的D_(490 nm)≥0．43D_(po■) 0．57D_(neg)判为阳性,反之判为阴性。对采自14个猪场的364份猪血清样品进行检测,PRRS阳性率为51．4%,略高于HerdChek ELISA的阳性检出率49．7%。与HerdChek ELISA相比,间接ELISA的敏感性为94．5%,特异性为91．3%,总符合率为92．9%,Youden指数为0．86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性,并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。该方法的成功建立将为我国PRRS的防制工作作出贡献。     

检测猪瘟病毒抗体的PPA-ELISA试剂盒的研制

在我国,不能普及猪瘟血清学诊断技术的主要原因之一是实验材料来源和标准化问题。我们根据前文和吴明杰等报道的检测猪瘟病毒抗体的实验,试图研究用于猪瘟抗体诊断的PPA-ELISA试剂盒。 (一)PPA-ELISA试剂盒的制备 抗原包被的微量滴定板:将纯化猪瘟病毒抗原(制法另文报道)用0.1 MCB作1:200稀释后,按常规法进行包被,洗涤、封闭、甩干后装入塑料袋内,每盒4块。冻干酶标SPA     

黄芪多糖对猪瘟活疫苗免疫效果的影响

分别用1％的黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)、猪瘟疫苗专用稀释液稀释猪瘟活疫苗并免疫猪,比较免疫后不同时间段外周血中淋巴细胞增殖活性以及血清中的猪瘟抗体、白介素2(InterLeukin 2,IL-2)、白介素4 (In-terLeukin 4,IL-4)水平,综合评价黄芪多糖对猪瘟活疫苗免疫效果的影响,为临床使用提供理论依据.     

猪乙型脑炎病毒E-Ⅲ抗原域蛋白间接ELISA的建立及应用

该研究利用纯化后的流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)E-Ⅲ抗原域蛋白,将其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.试验的最佳反应条件为:最佳抗原包被浓度为17.5 μg/mL,血清抗体稀释度为1∶4,酶标二抗稀释度为1∶5 000,封闭液和稀释液用含0.4％ BSA的PBST.采用该方法对127份临床样品进行检测,结果显示,与商品试剂盒检测结果比较符合率达到90.00％.因此,该研究建立的流行性乙型脑炎间接ELISA检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性.     

应用PPA—ELISA检测鸡血清中禽分枝杆菌抗体的研究

用禽型提纯结核菌素(PPD)作包被抗原,建立了PPA—ELISA检测鸡结核病血清抗体的程序。筛选最佳包被抗原浓度为25μg/ml,待检血清稀释度为1:40倍,兔抗鸡IgG血清稀释度为1:800倍。检测了30份结核病鸡血清和30份健康鸡血清。两者OD值分别为x0.345和x0.086,P/N值为4.0(P<0.01)。     

基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫抗体Dot-ELISA检测方法的建立

以建立Dot-ELISA检测犬心丝虫血清抗体的方法,用纯化的犬心丝虫MTFP基因蛋白为包被抗原,进行条件优化,筛选最佳反应条件,并进行敏感性、重复性和特异性等试验。结果表明,建立的犬心丝虫Dot-ELISA检测方法最佳抗原包被浓度为0.5μg·片-1;待检样品血清最佳稀释比例为1∶50;HRP标记兔抗犬抗体最佳稀释比例为1∶4 000;建立的Dot-ELISA方法敏感性为1∶200;批间重复试验证明,该方法具有良好的重复性,且与犬等孢球虫阳性血清和犬蛔虫阳性血清没有交叉反应;利用建立的方法对吉林省某地的62份待检血清进行检测,结果阳性率为4.8%。研究成功建立了基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫Dot-ELISA检测血清抗体方法,为犬心丝虫病流行病学调查和临床诊断提供了新技术。     

猪瘟流行毒株E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】表达猪瘟保护性抗原E0蛋白,用以建立猪瘟抗体检测方法,为进一步开发诊断试剂盒和研究E0蛋白的免疫学功能奠定基础。【方法】将猪瘟野毒株FJ237-E0基因插入原核表达载体pET32a中,以BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,将表达的重组蛋白通过His亲和层析柱进行纯化,以纯化的His-E0融合蛋白作为诊断抗原,通过探索抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。【结果】成功克隆了CSFV E0基因,其核苷酸序列为687 bp,编码229个氨基酸。经His亲和层析柱纯化检测纯度为0.587 mg/mL;SDS-PAGE电泳结果显示,表达的E0蛋白分子质量约为50.3 ku,表达的重组蛋白为可溶性蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%;ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为100 ng,血清稀释倍数为1∶30,建立的ELISA方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的阳性符合率为92.3%,阴性符合率为85.7%。【结论】建立的ELISA检测方法,不但为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学监测手段,也为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

某规模猪场猪瘟抗体水平的监测与分析

为监测分析生产母猪群的猪瘟抗体水平,合理制定猪瘟疫苗免疫方案,对某规模猪场1栋29头断奶母猪在猪瘟疫苗免疫前、免疫后30 d的血清样品进行检测。结果表明:免疫前、后的抗体阳性率分别为75.9%、93.1%,大部分生产母猪在疫苗免疫30 d后抗体水平有所提升,但仍有6.9%的生产母猪在加强免疫后,抗体水平仍为阴性;对采样血清进行猪瘟病原检测,PCR检测结果表明:加强免疫后抗体为阴性的2份血清为阳性,其余血清全部为阴性。