不同浓度秋水仙素和nocodazole对绒山羊成纤维细胞周期同步化的影响

本试验旨在探索更加优化的条件,使绒山羊成纤维细胞经处理后更多的处于有丝分裂G2/M期。本研究分别采用秋水仙素和nocodazole试剂对绒山羊成纤维细胞进行周期同步化处理,用流式细胞仪检测G2/M期的细胞数量并进行比对,观测最佳作用浓度。结果表明,秋水仙素的使用浓度不宜过大,且添加秋水仙素时间的不同也会对试验结果产生明显的影响。另外在相同条件下,经nocodazole处理的绒山羊成纤维细胞周期同步化效果比秋水仙素好,最优的处理条件是300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h,所得G2/M期的细胞所占比例为15.10%。结果提示,对于绒山羊的成纤维细胞来说,细胞周期同步化处理时选择nocodazole更好一些。     

大鼠成纤维细胞同步处理的流式细胞仪分析

目的 :研究 SD大鼠成纤维细胞同步处理后的各细胞周期的变化 ,探讨供体细胞的细胞周期对核移植胚胎发育的影响。方法 :分离培养 SD大鼠皮肤成纤维细胞 ,传 3～ 5代 ,分别经血清饥饿 2～ 6d和 1 0 mg/ ml nocodazole处理 2 4 h,流式细胞仪分析处理组和对照组的细胞周期百分比。结果 :血清饥饿、nocodazole处理及对照组的 G0 + G1期成纤维细胞的百分比 ( % )分别为 74.5± 4.4、49.5± 4.65和 5 0 .1 2± 3.9;G2 / M期细胞的百分比 ( % )分别为 :1 9.2 5± 4.2、2 5 .98± 2 .7及 45 .9± 5 .2 1。结论 :血清饥饿能较好地使大鼠成纤维细胞同步于 G0 和 G1期 ;nocodazole处理则使细胞较大程度同步于 G2 和 M期。     

VPA对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)丙戊酸(VPA)处理对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响,试验采用培养到第3代的牛胎儿成纤维细胞经VPA处理后,进行细胞生长曲线绘制及形态、活力、细胞周期的检测,并通过Real-time PCR检测Oct4和Cdx2的表达情况,经梯度浓度的VPA处理牛胎儿成纤维细胞,于24 h后观察细胞形态。结果表明:当VPA浓度高于0.5 mmol/L时,细胞开始出现异常形态,死细胞数目增多。0.5 mmol/L VPA处理牛成纤维细胞24 h可以显著抑制细胞活力,可将60%以上细胞的周期阻滞在G0/G1期;但处理48 h将导致细胞染色体整倍率显著下降。与对照组相比,VPA处理后,Oct4的表达量显著升高,而Cdx2基因的表达量则显著降低。说明用HDACIs VPA处理过的牛成纤维细胞作为体细胞核移植的供体细胞,可能更有利于克隆胚胎重编程及发育。     

牛卵母细胞质内注射体细胞核移植胚的早期发育

研究牛皮肤成纤维细胞的处理方式对卵质内直接注射法构建的核移植胚胎发育的影响，同时比较了MⅡ期与TⅡ期卵母细胞作为受体的效果。结果表明：在细胞核注射前对供体细胞作低渗处理可明显提高胚胎构建的成功率和早期发育能力。牛皮肤成纤维细胞是否作G1／G0期同期化处理，对核移植胚胎的发育没有明显的影响。发现供核细胞在悬浮情况下作休眠处理，所得核移植胚胎的发育能力与贴附休眠的细胞基本相同，且悬浮休眠3d后的细胞无需再作低渗处理便可用作细胞核注射。MⅡ期或TⅡ期卵母细胞作为胞质内核注射受体，对牛体细胞核移植胚胎的早期发育没有明显影响。     

AuroraA激酶在猪卵母细胞成熟分裂过程中的动态分布及其与微管蛋白相关性分析

为探讨Aurora A激酶在猪卵母细胞成熟过程中的动态分布及其与细胞微管蛋白相关性,采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术,检测Aurora A蛋白的动态分布与亚细胞定位,然后分别使用Aurora A特异性抑制剂(MLN-8054)、微管蛋白抑制剂(秋水仙素)处理猪卵母细胞,研究Aurora A与细胞骨架分布的相关性。结果显示:在生发泡(GV)期,Aurora A主要分布在细胞质中,在第一次和第二次减数分裂中期,即MⅠ和MⅡ期,Aurora A则主要伴随着纺锤体分布,与纺锤体有着相似的亚细胞定位;使用Aurora A特异性抑制剂MLN-8054处理细胞后,与对照组相比,纺锤体形态异常的比例显著增加;使用秋水仙素处理细胞后,α-微管蛋白结构紊乱地分布在染色体周围或消失,而Aurora A蛋白或以异常形态伴随纺锤体分布,或消失。结果表明:猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora A与纺缍体微管的分布密切相关,并具有明显的阶段性特点,Aurora A可能通过参与调节纺锤体微管的组装进而参与猪卵母细胞减数分裂的调控。     

供体细胞种类及性别对猪体细胞核移植效果的影响

本研究通过比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞、卵丘细胞和不同性别猪胎儿成纤维细胞的核移植效果,探讨供体细胞的种类及性别对猪体细胞核移植重构胚胎发育潜力的影响。结果表明:胎儿成纤维细胞的融合率(64.74%)高于颗粒细胞的融合率(51.05%)和卵丘细胞的融合率(56.89%),但3种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显著(P>0.05);胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞均可作为供体细胞用于构建猪体细胞核移植的重构胚。雄性胎儿成纤维细胞核移植重构胚的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞重构胚的融合率和分裂率相比差异不显著(P>0.05),但雄性胎儿成纤维细胞核移植重构胚的囊胚率显著低于雌性胎儿成纤维细胞核移植重构胚的囊胚率(P<0.05)。     

miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响

观察miR-21与Nocodazole联合作用对小鼠成肌细胞C2C12周期的影响。分别以0、200、300、400、500、600 nmol/L Nocodazole处理C2C12细胞24 h,流式细胞仪检测细胞周期,间接免疫染色激光共聚焦显微镜观察细胞有丝分裂器α-微管蛋白(α-tubulin)排列。转染miR-21 mimics/NC和inhibitors/NC,24 h后,添加400 nmol/L的Nocodazole处理24 h,流式细胞仪检测细胞周期。结果表明:Nocodazole使C2C12细胞同步化的最佳浓度是400 nmol/L;过表达miR-21 mimics之后,与对照组相比,G0/G1,S期细胞百分比极显著增加,G2/M期细胞百分比极显著减少(P0.01);添加抑制剂后,与对照组相比,添加抑制剂(inhibitors)的C2C12细胞中处于G0/G1期的细胞比例显著高于对照组,而处于G2/M期的细胞比例显著低于对照组细胞(P0.05);正反试验结果证明,miR-21促进C2C12细胞周期进入S期。为进一步研究miR-21对C2C12细胞的作用机制奠定基础。     

胎儿成纤维细胞的培养分离方法对猪体细胞核移植胚胎发育潜力的影响

研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%～80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);(2)猪胎儿成纤维细胞冷冻-解冻后的核移植分裂率和囊胚发育率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),但融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;(3)采用组织块法和酶消化法分离得到的胎儿成纤维细胞所构建的重构胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。表明100%长满汇合培养是较好的猪胎儿成纤维细胞培养处理方法;猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;组织块法和酶消化法均可用于分离培养猪体细胞核移植的胎儿成纤维细胞。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示，猪的卵丘细胞生长形成单层需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

以中国农业大学实验用小型猪香猪胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞3种细胞系为供体细胞进行核移植。比较了血清饥饿法和接触抑制法处理胎儿成纤维细胞诱导进入G0／G1期的效率，发现二者差异不显著（P〉0．05），血清饥饿2d和4d差异不明显，同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P〉0．05）。系统研究了影响克隆胚胎发育的供体因素：血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等，结果表明：血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；圆形光滑细胞有利于细胞融合，对早期发育无显著影响（P〉0．05）；不同个体、不同类型的供体细胞对克隆胚囊胚发育率有一定的影响。     

广西巴马小型猪供核细胞的传代培养和冷冻保存及肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA的表达

本试验旨在建立猪颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪不同组织来源成纤维细胞的分离及传代培养技术体系和冷冻保存方法,并比较猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA表达的差异,从分子水平上鉴定新生巴马小型猪肌肉成纤维作为供体细胞的可行性。运用组织块贴壁培养方法分离不同来源的组织细胞进行培养,并比较了常规冷冻保存和微量冷冻保存对细胞复苏率的影响,同时,运用实时定量PCR的方法检测猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因mRNA表达的动态变化。研究结果表明：（1）猪颗粒细胞单层细胞的生长需要5～6d;用组织块法获得猪胎儿成纤维细胞单层的生长时间为10～11d;用组织块法可以成功地对新生巴马小型猪的肌肉、肺、肾脏、心、睾丸组织的成纤维细胞进行分离和传代培养,肾和睾丸组织的成纤维细胞贴壁生长后,长满形成单层细胞需要12～13d,而肺、肌肉和心脏组织的则需要15～16d。（2）细胞的微量冷冻保存效果优于常规冷冻保存（P〈0.05）。（3）猪卵丘/颗粒细胞与新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDACl mRNA的相对表达量为1.000比0.985,两者差异不显著（P〉0.05）。新生广西巴马小型猪不同组织来源的成纤维细胞的分离及传代培养和微量冷冻法,丰富了这种猪体细胞的分离培养种类,为其体细胞核移植研究提供了丰富的供体细胞,并从表观遗传的角度分析,鉴定了新生巴马小型猪胎儿成纤维细胞与猪卵丘/颗粒细胞一样适合作供体,为核移植前的供体细胞鉴定提供了新的方法。     

猪颗粒细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养与冷冻保存试验报告

本试验利用从成熟后的猪卵母细胞中获得的颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为下一步猪体细胞核移植的供核细胞作好准备,为转基因猪的研究奠定了基础。对从成熟卵母细胞中获得的颗粒细胞进行分离培养和冷冻保存;采用室温消化法分离培养猪胎儿成纤维细胞。结果表明,接种后的原代颗粒细胞和猪胎儿成纤维细胞经过5～6d后均可连生铺满皿底,细胞排列有序,可用于继代培养;猪胎儿成纤维细胞进行冷冻解冻后可以存活。利用成熟后的猪卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速地分离与培养;通过室温消化法可以分离培养猪胎儿成纤维细胞,并且经过冷冻解冻后可以复苏存活,其存活率为80.2%。     

SAH对猪成纤维细胞体外增殖及甲基化水平的影响

本文旨在研究DNA甲基转移酶抑制剂S-腺苷高半胱氨酸（SAH）对猪成纤维细胞体外增殖活力、周期、凋亡和DNA甲基化水平的影响，为SAH在猪体细胞核移植上的应用提供理论基础。使用不同浓度的SAH(0、0.01、0.1、0.5、1mmol/L)处理猪成纤维细胞，通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期与凋亡，ELISA检测DNA甲基化水平，qRT-PCR检测相关基因表达情况。结果表明：与其余各组相比，0.1mmol/LSAH处理猪成纤维细胞24h对细胞活力和凋亡无明显影响，但可将细胞周期阻滞在G0/G1期（P<0.05）；与对照组相比，0.1 mmol/L SAH处理24 h可显著降低细胞中DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶相关基因DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达，同时，显著提高细胞周期调控基因P21、P27的表达，但对凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达无明显影响。总的来说，0.1 mmol/L SAH处理24 h效果优于其他组，对细胞损伤较小，可通过影响DNA甲基转移酶相关基因表达来参与调控DNA甲基化水平。     

不同刺激剂PHA和ConA对绒山羊淋巴细胞有丝分裂中期化的影响

试验旨在探索使较高比例的淋巴细胞富集在有丝分裂G2/M期的最佳条件。运用植物血凝素(PHA)和刀豆蛋白A(ConA)对淋巴细胞进行刺激使其增殖,培养一定时间后加秋水仙素对淋巴细胞进行同步化处理,用流式细胞仪检测G2/M期的细胞数量进行比对,观察试剂的最佳作用浓度和加秋水仙素的最佳时间。结果表明,采用PHA和ConA刺激淋巴细胞增殖的最佳作用浓度是60和5 μg/mL,且淋巴细胞经ConA刺激培养45 h再加秋水仙素处理5 h G2期的比例最高为58.38%。结果提示,就绒山羊的淋巴细胞来说,ConA刺激绒山羊淋巴细胞增殖的效果比PHA好,且摸索出细胞G2/M期的时间点至关重要。     

转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因（pGH/IGF-Ⅰ）猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。     

体细胞核移植生产梅山猪

本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250 bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2、G3、G4和G5代的融合效率差异不显著(P>0.05),但G5代作为供体细胞核移植的重组胚胎卵裂率显著高于G1、G2、G3和G4代(P<0.05);使用G5代的胎儿成纤维细胞作为供核细胞,通过手术移植的方法,将重构胚胎移植到二元后备母猪体内,结果成功地获得了体细胞克隆梅山仔猪,并且仔猪全部为雄性胎儿,说明该性别鉴定方法不但操作简单,而且准确度高;经微卫星DNA 多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为中国优质猪品种改良、保种、性别控制及建立人类疾病模型等研究提供有效可行的方法,为批量生产克隆优秀种猪提供了坚实的理论基础。     

miR-1307在猪卵巢颗粒细胞周期中的作用

为了解猪miR-1307序列和结构特征,阐明其在猪卵巢颗粒细胞周期中的作用,利用生物信息学方法分析猪miR-1307的序列特征、染色体定位和潜在的生物学功能;在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中转染miR-1307模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor),利用流式细胞术检测细胞周期。结果显示:猪miR-1307前体序列长度为80 bp,其核苷酸序列(包括成熟序列和种子序列)和基因组定位等与哺乳动物其他物种高度一致;功能富集分析发现miR-1307靶基因富集在rRNA分解代谢进程和蛋白酪氨酸磷酸酶活性等多个重要的生物学进程和分子功能中;在猪卵巢颗粒细胞中,过表达miR-1307可使G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例显著降低(P<0.05);抑制miR-1307可使G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例显著增加(P<0.05)。结果表明:miR-1307是猪卵巢颗粒细胞周期的重要调节因子。     

从有丝分裂到肿瘤形成:Plk1功能研究进展

Plk1是真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作为Polo样激酶家族的重要成员之一,对细胞周期具有重要的调控作用。通过磷酸化不同的特异性底物,Plk1具有促进中心体成熟及纺锤体两极分配,控制有丝分裂启动,促进染色体列队,促进胞质分裂等一系列作用。新近研究表明,Plk1还与DNA损伤应答、肿瘤形成、胚胎早期发育密切相关。本文就Plk1在细胞有丝分裂中发挥的一系列调控作用,DNA损伤发生时如何参与细胞阻滞的启动与逆转,促进DNA损伤修复,Plk1的表达异常与肿瘤发生的因果关系,以及Plk1在促进胚胎早期发育的应用前景等进行综述,以供相关研究参考。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。     

转hTERT基因的山羊胎儿成纤维细胞的生物学特性及其表达分析

用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。