马波沙星单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的初步建立

马波沙星(MBF)是一种氟喹诺酮类抗菌药。本试验利用碳二亚胺法合成马波沙星免疫原和包被原,经紫外分光光度法、SDS-PAGE和免疫学方法,鉴定人工抗原合成成功。通过免疫小鼠和单克隆抗体技术,获得2株可分泌马波沙星抗体的杂交瘤细胞株(5G2和7H5),并将建筑细胞注入小鼠的腹腔内,获得腹水型单克隆抗体。经过纯化和ELISA鉴定,结果表明5G2株单克隆抗体的效价较高,达1.28×10^5,其单抗亚型是IgG2b,轻链是Kappa。经ELISA方法优化了最佳封闭液和抗原抗体的最佳工作浓度,当MBF药物浓度在100~5000pg/mL时,有良好的线性关系,线性方程y=0.3798x-0.6613,R^2=0.9872,IC50=1.029pg/mL,LOD=45.13pg/mL,LOQ=322.59pg/mL。     

马波沙星原料质量标准的建立

作为《中国兽药典》2020年版科研任务的一部分,研究制定马波沙星原料的质量标准。标准研究的核心内容是有关物质检查、残留溶剂检查和含量测定方法。建立的质量标准考察项目全面,能有效地控制马波沙星原料的质量。     

马波沙星研究进展

马波沙星作为一种专用于动物的新型第3代氟喹诺酮类广谱抗菌药,其可用于狗、猫、猪、牛等动物的呼吸道、消化道、泌尿道及皮肤感染问题,具有吸收快速且彻底、对组织渗透性强、分布范围广泛特点,同时,其在血浆和组织中的含量较高,消除半衰期长、生物利用度高的良好特性。本文主要对马波沙星的作用机制、药动学、药效学及临床使用、不良影响及注意事项进行综述,为马波沙星在临床使用提供一定的参考价值。     

马波沙星的研究进展

概述了马波沙星的理化性质、合成途径、作用机制与体外抗菌活性、安全性以及含量或残留检测方法.马波沙星是动物专用的新型氟喹诺酮类抗菌药,主要通过抑制细菌拓扑异构酶的活性而发挥作用,具有抗菌谱广、安全高效、交叉耐药少等特点,在防治动物疾病领域具有广阔的应用前景.     

兽药人工抗原合成的研究进展

在国家大力鼓励发展畜牧业的同时，兽药残留引起食物中毒和影响畜禽产品出口的报道越来越多，且随着近年来高效、低毒、低残留兽药的开发利用，对残留限量的要求也越来越高，而可靠、灵敏和实用的残留分析技术是检测和控制兽药残留、保证使用者安全和避免国际间有关贸易争端的重要前提。     

HPLC-DAD法检测马波沙星片中马波沙星氧化物的研究

建立并验证了高效液相色谱法测定马波沙星片中马波沙星氧化物含量的方法。试验采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(65∶32∶3)为流动相,流速1.0 m L/min,柱温30℃,检测波长为210～400 nm。试验结果表明:马波沙星氧化物在0.5～100μg/m L范国内线性良好,R^2=0.9997,平均回收率为95.9%(n=9),RSD≤1.5%。方法检测限为0.2μg/m L,专属性好,可用于马波沙星片的质量控制。     

人工抗原的合成及单克隆抗体的纯化

制备单克隆抗体，建立优化ELISA方法检测兽药残留过程中，人工抗原的合成是较重要的步骤。对人工抗原合成时半抗原和载体的选择，化学反应的类型及应注意的事项进行了阐述，以期促进兽药残留分析的发展。     

马波沙星注射液无菌检查方法的建立

对马波沙星注射液的无菌检查方法进行适用性研究。按《中国兽药典》2015年版一部附录1101进行试验,采用薄膜过滤法对马波沙星注射液进行无菌检查。结果:马波沙星注射液经用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜,每膜每次100 mL,冲洗6次后,试验组菌生长良好,与阳性对照组一致。结果表明,薄膜过滤法可用于马波沙星注射液的无菌检查。     

马波沙星的致突变性和致畸性研究

选用Wistar大鼠和昆明系小鼠对马波沙星的遗传毒性进行研究。试验结果显示，马波沙星在抑菌剂量之下对鼠伤寒沙门氏菌不产生致突变作用；马波沙星不引起小鼠骨髓有微核多染红细胞率增加；马波沙星不引起雄性小鼠生殖细胞染色体畸变而造成的早期胚胎死亡；20mg／kg b．w．和100mg／kg b．w．剂量马波沙星对母鼠的生殖机能和胎鼠的生长发育无明显影响，对胎鼠不产生致畸作用，500mg／kg b．w．剂量马波沙星对胎鼠体长和骨骼发育有一定影响，但不存在剂量反应关系。上述结果表明，马波沙星无明显的致突变性和致畸性。     

药马波沙星的加速和长期稳定性研究

考察了第三代喹诺酮类抗菌药马波沙星在高温、高湿、光照以及加速试验和长期试验中的稳定性进行了测定,为马波沙星再生产、包装、贮存、运输条件提供了有力的科学依据,并通过长期试验确定了马波沙星的有效期。     

植物表达抗原蛋白及其免疫原性的研究进展

因利用植物生物反应器表达疾病抗原蛋白用于疫苗生产具有安全、廉价和易推广等独特优势,现已成为生物技术领域的研究热点之一。本文对利用植物生物反应器生产口服疫苗的研究进展及存在的弊端如蛋白产量低、口服疫苗易消化降解、免疫耐受等问题进行了综述,并探讨了其潜在的解决办法。     

二氟沙星人工抗原的合成与鉴定

通过化学方法合成了二氟沙星人工免疫原和包被原；采用碳二亚胺法将半抗原二氟沙星与载体蛋白BSA连接制备人工免疫原；并采用氯甲酸异丁酯法将二氟沙星与载体蛋白OVA连接制备人工包被原，经FeCl3显色反应、紫外扫描分析和动物免疫试验证实人工抗原合成成功。这对抗二氟沙星单克隆抗体的制备具有重要意义。     

新霉素人工抗原的合成与鉴定

用水溶性碳化二亚胺(EDC)法将新霉素(NEO)偶联于栽体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(O-vA),合成免疫原BSA-NEO和包被原OVA-NEO,用红外扫描(IR)、SDS-PAGE法进行鉴定;用BSA-NEO免疫BALB/C小鼠,问接ELISA测定多抗上清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性.结果表明,BSA-NEO的红外光谱与BSA相比发生了改变,BSA-NEO的电泳条带与BSA的相比出现了明显的拖尾现象;通过系列ELISA鉴定,获得了高价、敏感、特异的pAb,为NEO残留免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定

用戊二酸酐将盐酸莱克多巴胺活化成莱克多巴胺-戊二酸酐半醛,用混合酸酐法将莱克多巴胺-戊二酸酐半醛与KLH和BSA偶联,合成免疫原和包被抗原,经核磁共振法和紫外吸收法鉴定,偶联成功.用紫外吸收法测定免疫原和包被抗原的偶联比分别为24：1和2.5：1.用免疫原免疫新西兰白兔,采用间接ELISA法检测抗体效价,采用间接竞争ELISA法检测IC50值,获得了效价为1：6 000以上、IC50值为10 ng/mL的多克隆抗体,证明合成的人工免疫原具有免疫原性.     

洛美沙星人工抗原的合成及鉴定

通过化学方法制备了洛美沙星的免疫抗原和包被抗原;分别采用碳二亚胺（EDC）法和氯甲酸乙丁酯法把洛美沙星与BSA进行偶联制备了人工免疫抗原LOM-BSA,EDC法制备了包被抗原LOM-OVA,经非变性PAGE、紫外分光光度法测定了人工合成抗原的偶联比,EDC法和氯甲酸乙丁酯法制得的LOM-BSA两分子结合比率分别为4∶1和11∶1,LOM-OVA中两分子结合比率为12∶1。这为洛美沙星单克隆抗体的制备奠定了基础。     

沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定

通过沙丁胺醇(SAL)与琥珀酸酐的醇解反应制备SAL的琥珀酸衍生物,用EDC法将SAL琥珀酸衍生物偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-SAL和包被原OVA-SAL,用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SAL免疫BALB/C小鼠,间接ELISA测定多抗上清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,BSA-SAL的UV与BSA、SAL的相比发生了改变;通过UV分析,SAL-HS与BSA的分子结合比约为7.2∶1;通过系列ELISA鉴定,获得了高价、敏感、特异的pAb,为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

Testing the immunogenicity of the dermal antigen in Marek's disease virus]

An experiment was performed to study the immunogenicity of the dermal antigen of Marek's disease virus, extracted from the skin of 30-day-old chickens, infected with Marek's disease virus on the first day of life. Three kinds of samples were tested: (1) dermal antigen centrifuged at 10 000 g per 0.5 h, (2) dermal antigen centrifugated at 10 000 g per 0.5 h and 100 000 g per 1 h, (3) dermal antigen treated like sample (2) and partly purified by DEAE-cellulose chromatography. Samples (1) and (2) were inoculated to two-day-old chickens and the vaccination was repeated, using complete Freund's adjuvant, 21 days later. Sample (3) was inoculated to two-day-old chickens with DEAE-dextran. All the three groups were challenged together with the controls (non-vaccinated chickens) on the seventh day after the first vaccination. A reduction of mortality was observed in the chickens vaccinated with and re-vaccinated with sample (1) (23.07%) and in the chickens vaccinated with sample (3) (30.76%). The chickens of the latter group were the last to start dying from Marek's disease--only after the 10th week of life. In the chickens which had been vaccinated and revaccinated with sample (2) the mortality was not reduced. The study is continued, with particular emphasis on the relationship of DEAE-dextran to protection against Marek's disease.     

多拉菌素人工抗原的制备与鉴定

多拉菌素(25-环己基阿维菌素，doramectin，DOR)为阿维菌素类药物家族中的一员，采用突变生物法合成(结构见图1)。自1993年发现起，就被认为是其家族中最优秀的驱虫药，在畜牧业生产中得以广泛应用，因而其残留问题势必引起大众的关注。目前兽药残留检测技术的研究方兴未艾，其中快速筛选技术，是保障动物性食品安全的主流方向，最为常用的是ELISA方法和试纸条技术，     

吲哚美辛人工抗原及其多克隆抗体的制备

为了建立吲哚美辛(indomethacin,IDM)残留的免疫学检测方法,采用碳二亚胺法将载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)分别与IDM偶联,人工合成免疫原(IDM-BSA)和包被原(IDM-OVA)。通过紫外分光光度法、SDS-PAGE、ELISA等方法鉴定人工抗原的合成效果;将IDM-BSA免疫小鼠,利用iELISA和icELISA来测定抗体血清效价。结果显示:IDM能与BSA和OVA成功偶联,通过免疫小鼠获得高效价的多克隆抗体,效价可达1∶6.4×10~4,半数抑制率为27.23 ng/mL。本研究结果为建立动物源性食品中IDM残留的免疫学检测方法奠定基础。