抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的研究：Ⅲ.应用单克隆抗体快速诊断猪瘟

本文介绍了应用酶标单抗(HRP-McAb)的涂片法、双抗体夹心 ELISA、斑点 ELISA 和微量细胞培养联合免疫酶测定法检测猪瘟病毒抗原,结果4种方法检出率基本一致,具有快速、特异、敏感、准确、简便、经济和判断客观的诊断价值,可作为疫区流行病检查和检测猪瘟病毒抗原应用。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒K145R蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫诊断学试剂,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组K145R蛋白,制备并鉴定K145R蛋白单克隆抗体.结果显示,成功构建pET28a-K145R表达载体,表达得到大小约为17 ku可溶性的重组K145R蛋白.Western blot分析证实,重组K145R蛋白与ASFV阳性血清有良好的反应...     

诊断猪瘟病的理想试剂——抗猪瘟病毒单克隆抗体

<正> 目前,我国普遍应用猪瘟兔化弱毒苗,因而绝大多数猪的体液内都含有特异性抗体,也就无法应用检查特异性抗体的办法来诊断猪瘟病。近年来,应用猪瘟病毒高免血清标记荧光素诊断新技术,比传统的动物实验、血清学鉴定方法发展了一步。但由于受到同属病毒交叉反应的影响,仍然有相当程度的假阳性,如猪瘟荧光抗体对牛腹泻病毒(称BVDV)、猪瘟兔化弱毒均呈阳性反应. 能够认别单一抗原决定簇的单克隆抗体的出现和应用,解决了这一难题。现将荷兰     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的研究——猪瘟病毒抗原的提纯

本文介绍了用 PEG 和蔗糖密度梯度区带离心纯化猪瘟病毒的方法和步骤。先用 PEG 沉淀浓缩猪瘟兔化弱毒感染的牛睾丸细胞培养液,再经蔗糖密度梯度区带离心,出现4条区带,其中病毒感染力最强的位于Ⅱ带,其次为Ⅰ带,蛋白质含量多为0.14～0.19毫克/毫升和0.21～0.12毫克/毫升。电镜检查可见带有膜囊的病毒粒子,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ带均各出现一条明显蓝色条带外,在它前后侧还隐约可见一条浅带。用这些方法浓缩提纯兔化猪瘟弱毒效果较好,且较简便易行。     

环丙沙星单克隆抗体的制备

【目的】制备环丙沙星(Crprofloxacin,CPFX)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行鉴定,为畜产品CPFX残留的快速检测提供技术支持。【方法】采用碳二亚胺法(EDC),将载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)分别与CPFX偶联合成免疫抗原CPFX-BSA和包被抗原CPFX-OVA,经紫外(UV)扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术筛选分泌CPFX mAb的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备CPFX mAb,并对其染色体核型、效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】UV和SDS-PAGE鉴定结果表明,人工抗原偶联成功;免疫的5只小鼠血清抗体效价均达到了1∶105左右,其中4号小鼠血清CPFX抑制效价较高且IC50最低(17.21μg/L),融合后筛选出1株敏感特异的杂交瘤细胞,命名为3D2。3D2细胞培养上清效价为1∶(1.28×103),腹水效价为1∶(1.6×105)。CPFX mAb对CPFX的IC50为9.95μg/L,对恩诺沙星的交叉反应率为128.39%,与其他同系的喹诺酮类抗生素的交叉反应率很低。【结论】获得了高效价、敏感、特异的抗CPFX mAb,为CPFX残留的快速检测奠定了技术基础。     

单克隆抗体制备的关键因素

单克隆抗体在实验室和临床上有广泛的应用,它是基础免疫研究、诊断测试和疫苗质量控制方面必要的研究工具。本文主要阐述了单克隆抗体生产中的关键步骤,特别是抗原的准备、细胞和动物的考虑(选择)、佐剂及复合物的制备、注射方式、细胞融合和腹水收集方法,以期在单抗制备过程中减少动物的痛苦,获得最佳的免疫反应。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的研究——Ⅱ抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用聚乙二醇沉淀浓缩纯化猪瘟兔化弱毒中国株(SFV-C)免疫 BALB/C 小鼠,取其脾脏,制备淋巴细胞,与 FO 骨髓瘤细胞融合,经 EliSA 检测和有限稀释法克隆化,最后筛选出5株对SFV 的单克隆抗体杂交瘤细胞.所制成的腹水抗体,一株只对 SFV-C 发生特异性反应,四株与SFV-S,SFV-F 及 BVDV oregon 发生微弱的交叉反应.细胞上清液的 EliSA 效价为1:800～1600,腹水效价为1:10~6～10~7.     

丙烯酰胺单克隆抗体的制备

丙烯酰胺分子量小,结构简单,因此制备其特异性抗体比较困难.试验将丙烯酰胺与间巯基苯甲酸反应合成丙烯酰胺半抗原,半抗原偶联KLH载体蛋白合成抗原,通过免疫制备单克隆抗体,并对其进行了抗血清的效价、半抑制率、交叉反应测定.结果表明:免疫原为AM-KLH,包被原为AM-OVA测定的抗血清效价最高为1:32000倍,其半抑制率(IC50)为120.323 ng·mL-1,该抗体与丙烯酰胺近似物的交叉反应率均<1.48.探索了丙烯酰胺单克隆抗体的制备方法,为丙烯酰胺快速检测方法的建立提供了新的思路.     

SEB单克隆抗体的制备

[目的]获取能应用于快速检测致病微生物的蛋白质芯片点印用单克隆抗体。[方法]用金黄色葡萄球菌B型肠毒素（SEB）作为抗原免疫BALB/C小鼠,然后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/O融合,再进行选育、检测、鉴定等。[结果]成功获得了分泌SEB单克隆抗体的杂交瘤细胞。[结论]抗体特异性经酶联免疫吸附测定法检验,单克隆抗体细胞特异性强,能够用作蛋白质芯片点印的材料。     

猪瘟单克隆抗体诊断技术的推广与应用

抗体是分子识别的重要载体,被普遍应用到各猪病的诊断实践中.而单克隆抗体是通过将抗原注入宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的,将该项技术用于猪瘟及强、弱毒的鉴别诊断是不错的尝试和选择。由此文中展开论述,分析当前猪瘟流行疫情,思考猪瘟单克隆抗体诊断技术在猪瘟诊断中的应用推广.     

用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验监测猪瘟抗体发现隐性猪瘟

用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验监测猪瘟血清抗体.测得该场母猪40份血清样品中,猪瘟弱毒抗体效价OD值较高,有100%保护率,测得仔猪240份血清样品中,猪瘟弱毒抗体效价OD值适中,有87.6%的保护率.但是发现母猪群中有10%隐性猪瘟感染,仔猪群中有3.7%隐性猪瘟感染,其强毒抗体效价OD大于0.5,体内带有猪瘟病毒,且不显临床症状.遇见免疫接种、转群、气候骤变等应激,则发生非典型猪瘟,揭示了隐性感染的母猪是垂直传递和水平传播的传染源.     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备

以LF(牛乳铁蛋白)为抗原对BALB/C小鼠进行免疫,利用杂交瘤技术进行融合,制备了3株抗牛LF的杂交瘤细胞,并对其浓度、上清效价、腹水效价、抗体亚类、分泌单克隆抗体稳性定、单克隆抗体分子量等进行鉴定。结果表明,抗体分泌稳定,腹水效价达到106,间接ELISA、Western blot结果显示3株单抗均与FL发生特异性结合;Ig亚类鉴定均为IgG,且轻链均为K链。     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备抗三聚氰胺单克隆抗体,并对其效价、敏感性与特异性进行测定。[方法]通过三聚氰胺人工抗原MEL-BSA免疫BALB/c小鼠以及细胞融合等方法,获得分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并利用小鼠体内腹水诱生法制备抗三聚氰胺单克隆抗体;采用间接竞争ELISA法鉴定单克隆抗体的效价、敏感性与特异性。[结果]经小鼠免疫、细胞融合与亚克隆后获得了2株分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B12和2H9;间接ELISA检测结果显示,杂交瘤细胞1B12和2H9腹水型单抗的效价分别为1∶25 600与1∶12 800,IC50分别为8.0 ng/ml与8.3 ng/ml,且该2种单抗只与三聚氰胺有反应,与三聚氰胺类似物无交叉反应。[结论]该研究获得了高效价、高灵敏度的三聚氰胺特异性单克隆抗体,为后续研究提供了良好基础。