基于CMV启动子构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统

构建了一种利用CMV启动子的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)反向遗传操作系统。在获得XX-2012株HP-PRRSV全长cDNA的基础上,将CMV真核启动子序列置于该病毒全长cDNA的5′端,获得含有CMV启动子和XX-2012株HP-PRRSV全长cDNA克隆的重组质粒,将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞拯救病毒。结果显示:转染细胞后获得了拯救病毒,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记(突变产生的MluⅠ酶切位点)。本试验建立了一种简单、操作方便、节约时间和成本的HP-PRRSV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展HP-PRRSV的相关研究奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.     

猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具.     

异源5′非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reporoductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）基因组5′非翻译区（untranslated region,UTR）对病毒复制转录等过程至关重要,但其发挥作用的机制尚不清楚。本实验室将欧洲型PRRSV 5′UTR替换入北美型PRRSV弱毒株感染性克隆pAPRRS的骨架中,构建pAPLV5。经过DNA转染入MARC-145细胞系中,两次传代后,拯救出嵌合病毒vAPLV5。通过对嵌合病毒的全长测序发现,嵌合病毒基因组较亲本病毒发生了碱基突变,突变主要集中于Nsp2和Nsp9位置。将Nsp9位置（病毒的RNA依赖的RNA聚合酶,RNA-dependent KNA povymerase,RdRp）的4处突变位点引入嵌合病毒的感染性克隆pAPLV5,所构建的4个突变嵌合克隆转染MARC-145细胞后无需传代即产生细胞病变（cytopathic effect,CPE）,且P0代病毒滴度较原嵌合病毒vAPLV5高。通过半定量负链和亚基因组检测发现,突变嵌合病毒的RNA合成水平也较亲本嵌合病毒高。由此推测PRRSV 5′UTR功能可能与RdRp相关,异源的5′UTR通过突变RdRp来发挥其调控作用,完成病毒拯救过程。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

5′端非病毒核苷酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆拯救的影响

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5′端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSV JXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5′端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5′端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID50/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID50/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5′端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5′端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5′端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。     

5'端非病毒核苷酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆拯救的影响

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID₅₀/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID₅₀/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化

反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定性以及降低经济成本是一个急需解决的课题。本研究在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统（pAJXM）的基础上,做了以下三方面的工作：（1）将T7启动子换成hCMV（人类巨细胞病毒,Human cytomegalovirus）启动子,从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程,直接通过DNA转染MARC-145细胞拯救病毒;（2）研究hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间最佳的碱基数目,使体内转染获得的病毒基因组5末端序列为病毒的真实序列;（3）在病毒基因组3末端添加丁型肝炎病毒核酶（delta hepatitis virus ribozyme,HDVr）序列,体内转染获得的病毒基因组3末端的非病毒序列通过核酶自动去除。研究发现,基于DNA转染的反向操作系统是可行的,并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3末端添加HDVr序列后,能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

查明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)致病性大幅增高的机制,进而研制用于防治流行PRRSV变异株的高效疫苗无疑是兽医工作者的当务之急.在弱毒株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS以及我室构建的高致病性HP PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,构建了nsp2替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆.将构建的嵌合克隆转染MA104,4d后观察到典型的CPE.通过RT-PCR和免疫荧光证明获得了一系列强弱毒株之间的嵌合病毒.这些嵌合病毒的构建成功和相应反向遗传操作平台的建立及应用,为研发预防HP PRRSV的高效嵌合疫苗奠定了基础.该类嵌合感染性cDNA克隆也为解析目前流行的HP PRRSV毒力因子和高致病力机制奠定了基础.     

口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重叠的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,出现致细胞病变效应(CPE)。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切、测序,表明人工设计的分子标记Bam HⅠ酶切位点消失,排除了亲本毒株污染的可能性。间接免疫荧光试验可以检测到绿色荧光,电镜观察可观察到病毒粒子,表明构建了具有感染性的OHM/02毒株全长cDNA克隆。病毒生长曲线表明,拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相似。OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建及拯救可为FMDV致病机理的研究提供一种重要工具,可促进疫苗的研发。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4传代致弱株HuN4-F30感染性克隆的构建及拯救病毒致病性分析

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Hu N4株传代致弱株Hu N4-F30感染性克隆,本研究利用高保真DNA聚合酶,分6个片段进行病毒全基因组序列扩增,并通过点突变在其基因组10 808位引入Mlu I作为分子标记。通过重叠延伸PCR在5'端上游引入CMV启动子,3'端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和牛生长素多聚腺苷酸化信号(BGH)。将各片段依次连接克隆于改造的p Belo BAC11载体中,构建含有全长HP-PRRSV致弱株c DNA感染性克隆p Belo BAC11-Hu N4-F30,并将全长质粒直接转染Marc-145细胞拯救出病毒。通过核酸鉴定与测序、分子标记鉴定、间接免疫荧光试验和动物致病性试验等进行鉴定。结果表明,拯救的病毒能够通过Mlu I酶切与亲本鉴别,拯救病毒的间接免疫荧光与亲本病毒一致,拯救病毒表现出低致病性。HP-PRRSV Hu N4-F30感染性克隆的构建与病毒的拯救,为进一步研究HP-PRRSV传代致弱机制奠定了基础。     

猪脑心肌炎病毒HB10株cDNA感染性克隆的构建

为建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株cDNA感染性克隆,本研究利用反向遗传操作技术,采用RT-PCR一次性扩增EMCV-HB10株全长基因组(包括5'和3'UTR)序列,并直接克隆于低拷贝载体pOK12中,构建了EMCV感染性重组质粒pOK12-EMCV-HB10。将重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果显示,转染细胞36 h后,出现典型的细胞病变。拯救病毒rEMCV-HB10全基因组经测序鉴定显示,与亲本病毒开放阅读框比较,其仅在1D基因出现两个核苷酸突变:即A37G(R13K)和G187C(M63I),该突变可以作为区别亲本病毒的标志。间接免疫荧光和生长曲线试验结果显示,这两个突变并不影响VP1蛋白的表达及病毒拯救,并且拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。本研究构建了感染性EMCV-HB10 cDNA克隆,为深入研究EMCV的致病分子机理提供了有效的反向遗传操作平台。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6和ORF6/7重叠区的分离(人工)改造病毒的构建及鉴定

为了研究重叠序列在病毒繁殖周期中所起的作用以及更好地操作感染性克隆,将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染性克隆ORF间（ORF5／6和ORF6／7）重叠区域分离并插入酶切位点,成功构建两个突变的全长质粒,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明：（1）两个全长质粒均能够进行病毒拯救,并产生明显细胞病变;（2）突变病毒具遗传稳定性;（3）病毒空斑形态及生长曲线与亲本毒株近似。表明PRRSVORF间重叠碱基的安排方式对病毒的感染性是非必需的,获得的两株突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗、研究PRRSV各编码蛋白功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,本实验采用RT-PCR方法将PRRSV-XH株的基因组序列分为6个片段进行扩增,连接至低拷贝载体pOKQ中,获得全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,经脂质体转染Marc-145细胞,观察细胞病变。经RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等试验验证,表明构建了具有感染性的PRRSV-XH株全长cDNA克隆。本实验为在分子水平上研究PRRSV的复制、致病机理和基因产物的功能等方面提供技术支持,并为构建新型病毒载体和开发安全有效的活病毒疫苗奠定基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒MD-2株感染性克隆的构建与突变分析

为构建禽网状内皮组织增生症病毒(REV)MD-2株的感染性克隆,将MD-2株的前病毒基因组全长克隆至pMD18-T Simple载体中构建MD-2全长质粒,经转染CEF细胞后进行病毒拯救及鉴定,并对拯救病毒进行了生物学特性研究。结果表明,成功构建了MD-2全长质粒,拯救病毒感染CEF细胞后用间接免疫荧光试验检测到病毒抗原;拯救病毒的生长特性与亲本病毒相比无明显差异。随后对env基因进行了多个位点的定点突变,并拯救出相应的突变株,结果显示env基因第1433位碱基突变后不能拯救出病毒,推断1433位的突变为致死性突变。MD-2株感染性克隆的构建和病毒拯救的研究为继续研究REV基因和蛋白功能提供了技术支持。     

两种启动子拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒ZJ-JX-2015株效率的比较研究

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率，本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G，形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后，分别克隆至含CMV启动子的p SMART-BAC载体和含T7启动子的p WSK-29载体中构建感染性克隆质粒p SMART-BAC-CMV-r PRRSV和p WSK-29-T7-r PRRSV，经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞；将后者转染BHK-21 (T7)细胞。48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代。通过观察细胞病变(CPE)，收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒。将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞，通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线。结果显示，各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE...     

猫杯状病毒2280株反向遗传系统的构建

为构建猫杯状病毒(FCV)2280株感染性克隆,本研究在FCV 2280株基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将FCV基因组中唯一的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为遗传标记;将基因组分为3段分别进行RT-PCR扩增,通过酶切依次克隆于pOK-12载体中,构建FCV基因组全长cDNA重组质粒。以其为模板经体外转录制备其全长基因组RNA,并在5'末端加帽,转染CRFK细胞,24 h后出现典型的细胞病变。提取出现细胞病变的病毒液的总RNA制备cDNA模板,PCR扩增FCV遗传标记片段并进行XbaⅠ酶切鉴定分析,表明拯救的病毒为FCV重组病毒。而且拯救的病毒生长动力学与亲本病毒无明显差异。本实验为进一步研究FCV的生物学特性和致病机制奠定了基础。