猪萨佩罗病毒原位杂交检测方法的建立

为了直观、原位且特异性的检测猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)在感染仔猪后器官和组织中病毒核酸的分布,本研究根据GenBank中PSV的5′端非编码区基因的保守序列设计并合成1对引物,利用PCR地高辛探针合成的方法制备成原位杂交检测探针,建立了PSV原位杂交组织切片检测的方法。应用该方法检测PSV感染仔猪小肠组织,结果表明阳性信号主要存在与在于肠绒毛上皮细胞和固有层淋巴细胞中,阴性对照无显色。该方法可以用于组织切片中的PSV核酸的定位,为猪萨佩罗病毒在感染仔猪后器官和组织中病毒核酸分布及致病机理研究奠定基础。     

猪萨佩罗病毒3C蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...     

宁夏两家猪场猪萨佩罗病毒的检测与多样性分析

为了解宁夏地区猪群中萨佩罗病毒(PSV)的感染流行情况,本研究通过RT-PCR的方法对不同区域的2个规模化养猪场的160份临床健康猪咽拭子和肛拭子样品进行了检测。试验表明,所检的2个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为61.25%,其中咽拭子检出率为7.5%,肛拭子猪检出率为58.75%。试验结果表明PSV在宁夏地区普遍存在。     

猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步临床应用

猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪腹泻、呕吐,猪萨佩罗病毒(PSV)可引起猪脑脊髓灰质炎、腹泻等多系统综合征,临床上这3种病毒混合感染很普遍,疾病症状相似,依靠临床症状和剖检变化很难对这3种病毒做鉴别检测,需借助实验室诊断方法.为了建立快速鉴别检测这种病毒的方法,本研究参照GenBa...     

华东部分地区猪群中猪萨佩罗病毒分子流行病学调查

为了解华东地区猪群中猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)感染流行情况,通过RT-PCR方法对该地区15个规模化养猪场960份猪粪便样本进行了检测.结果表明,所检测的15个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为17.2％,其中10周龄～20周龄的猪PSV最易感.进一步系统进化分析表明,所检阳性毒株同源性较高,不同地区的毒株交错分布在一起,不存在明显的地区差异,但大体可分为3个亚群,而且已有的国外PSV株均包括在这3个亚群中,这提示PSV可能至少存在3种不同的抗原亚型.     

双重RT-PCR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

猪流行性腹泻病毒、猪肠道病毒9型及猪嵴病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

旨在建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪肠道病毒9型(PEV-9)、猪嵴病毒(PKV)的三重RT-PCR法,并初步应用于临床样品检测。根据GenBank中PEDV和PKV基因序列保守区设计2对引物,参照文献合成1对PEV-9引物,在同一体系进行RT-PCR扩增,对引物浓度、退火温度、灵敏度、特异性等进行优化,应用该法对采自四川省6个猪场46份样品进行检测。结果表明引物量分别为PEDV 0.5μL、PEV-9 0.25μL、PKV0.25μL,退火温度为55℃时扩增效果最理想;本方法最低检测量分别为PEDV 5.97pg、PEV-9 0.11pg、PKV0.74pg;用该方法对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪萨佩罗病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒、猪源大肠杆菌、猪源沙门菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌和空肠弯曲杆菌等病原进行RT-PCR扩增时,均无非特异性扩增条带出现。对46份腹泻样品的检测结果显示,PEDV感染率为76.1%、PEV-9为73.9%、PKV为39.1%,3种病原在同一样本检出率达29.1%,表明存在混合感染或协同致病的可能;与单项RT-PCR法相比,阳性样本的检出符合率均在91%以上,表明该方法具较高可信度。建立的方法可快速、准确地检测3种猪腹泻病毒性病原,为病原学诊断和分子流行病学调查提供了有效技术支持。     

猪Deltacoronavirus RT-PCR检测方法的建立及其应用

猪Deltacoronavirus(PDCo V)是2014年在美国检测出的一种新型猪冠状病毒,能够引起感染猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状。为及时评估该病毒在我国猪群中的感染和流行情况,本研究根据Gen Bank中登录的PDCo V核苷酸序列设计并合成一对特异性引物,在我国首次建立了PDCo V的RT-PCR检测方法。研究结果表明,所建立的RT-PCR检测方法仅对PDCo V核酸具有特异性扩增,对其它猪主要病毒核酸的扩增均呈阴性,具有较强的特异性;对PDCo V最低检测限为4.05×103拷贝/μL,敏感性较高;采用该方法对2014年~2015年我国华东地区猪场的526份临床样品进行检测,结果显示PDCo V总阳性率为4.75%(25/526),其中腹泻样品中阳性率为25.76%(17/66),表明我国猪群中存在PDCo V感染。本研究建立的RT-PCR方法可以作为临床检测PDCo V的一种有效手段。     

CSFV强弱毒株双重RT-PCR方法的建立与应用

为了建立一种能在临床上快速鉴别猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)野毒和弱毒疫苗毒的检测方法,试验在对多株CSFV基因组序列比对分析后,选择特异保守区域设计2对引物构建CSFV强弱毒株双重RT-PCR方法,优化其退火温度,并检测该方法的特异性、敏感性及临床应用效果。结果表明:试验建立的双重RT-PCR方法能从CSFV弱毒疫苗毒和临床野毒株基因组中扩增出大小分别为447 bp和343 bp的特异性基因片段;最佳退火温度为55℃;应用该方法分别对繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗毒、猪口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗毒、猪乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗毒总RNA和猪伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗毒、猪细小病毒(PPV)灭活疫苗毒、猪圆环病毒(PCV)灭活疫苗毒的总DNA进行检测,均未见特异性条带,特异性好;对CSFV疫苗弱毒的最低RNA检出量为6.28 ng,敏感性高;对临床混合感染病料进行检测,能同时或单独检测到CSFV强毒和CSFV弱毒疫苗毒核酸。说明试验建立的双重RT-PCR方法特异性好,敏感性高,可用于CSFV强弱毒株的检测。     

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪伪狂犬病病毒（PRV）的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRV gE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重RT-PCR检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。     

猪瘟、猪蓝耳病双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了方便、快速检测猪瘟和猪蓝耳病混合感染病例,试验根据GenBank登录的猪瘟病毒(CSFV)和蓝耳病病毒(PRRSV)基因序列,分别设计合成1对引物,建立检测猪瘟、猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度进行优化。对优化后的RT-PCR方法进行特异性和敏感性试验,同时对临床样品进行检测。结果表明:采用建立的RT-CPR方法对CSFV、PRRSV进行扩增,分别扩增出508 bp和320 bp特异性片段,最佳引物浓度为0.4 pmoL/μL,最佳退火温度为55℃。采用该方法对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性乙型脑炎病毒不能扩增出任何片段,特异性良好。对CSFV和PRRSV最低核酸检出含量分别为32.4 ng和2.4 ng,具有较好的敏感性。对贵阳市某规模化猪场采集的临床疑似病料检出率为100%。说明成功建立了一种快速鉴别诊断猪瘟和猪蓝耳病的双重RT-PCR方法,该方法具有较好的特异性、灵敏性和临床应用性,为猪瘟和猪蓝耳病的快速、准确鉴别诊断和防控提供了有效手段。     

广东地区2016-2017年规模化猪场腹泻病原调查分析

为了解广东地区导致猪群腹泻病原的流行状况,对广东省部分地区的猪场进行猪群腹泻的流行病学调查,共采集腹泻样品273份,采用PCR和RT-PCR的方法检测能够造成猪群腹泻的病原,包括猪流行性腹泻病毒(PEDV),猪轮状病毒(PoRV),猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),以及近年开始流行的猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV),猪库布病毒(Porcine Kobuvirus,PKoV),猪博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV),猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)。检测结果显示,PEDV仍然是导致猪群腹泻的主要病原,而TGEV没有检测到。尤为突出的是PKV仅次于PEDV的高阳性率,因此其在猪群腹泻中的作用值得进一步探索。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的PEDV M基因序列,设计并合成1对特异性检测引物,PCR产物为457 bp。结果显示:特异性试验,猪瘟病毒(CSFV)、大肠杆菌、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,具有好特异性;敏感性试验,最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV DNA;126份临床上疑似为PEDV感染的病料,RT-PCR检测结果与商品试剂盒符合率为100%。表明本试验建立的PEDV RT-PCR检测方法可用于临床上PEDV感染引起的传染病病原学检测。     

2017—2019年华东地区猪场主要病毒性腹泻病原调查

本研究旨在了解当前我国华东地区引起猪腹泻的主要病毒性腹泻病原的流行情况，为该地区更好地开展猪腹泻病毒的防控工作提供临床数据。分别采用RT-PCR检测方法对2017—2019年华东地区35个场别594份临床样品检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）、猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）和猪萨佩罗病毒（porcine Sapelovirus，PSV）等5种猪的病毒性腹泻病原，并对其阳性率及混合感染情况进行统计分析。结果显示，2017—2019年的PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV及PSV的平均阳性率为分别为62.6%（372/594）、27.9%（166/594）、16.8%（100/594）、13.3%（79/594）及3.87%（23/594），二重混合感染中以PEDV+PDCoV及PEDV+PoRV为主，平均混合感染率分别为22.4%（133/594）和13.3%（79/594）。三重感染中以PEDV+PoRV+PDCoV混合感染为主，感染率为7.58%（45/594），未见四重及五重病原混合感染。2017—2019年PEDV平均阳性检出率最高，且常与PoRV及PDCoV发生混合感染，是当前华东地区猪病毒性腹泻类疫病的防控重点。TGEV和PDCoV在健康育肥猪及母猪的检出率中占比较大，表明隐性感染变得普遍，值得养殖户关注。除此之外，PSV的检出率远低于其他4种腹泻病毒。总之，随着2018年后养殖场加强生物安全防控措施和猪群管理，各病原检出率和阳性场检出率呈现逐年下降趋势。     

猪萨佩罗病毒对仔猪的致病性

猪萨佩罗病毒(PSV)是我国近年来新报道的仔猪腹泻病原,为深入了解PSV对仔猪腹泻的致病作用,本研究建立了PSV感染仔猪模型,通过对感染仔猪临床症状、剖检及组织病理学变化观察发现PSV能感染仔猪并导致发病,临床仔猪表现体温下降、出现腹泻症状,腹泻率可达80%,病死率20%。组织病理学观察肠道、肺脏及淋巴结病变明显,肠道绒毛受损,肺脏和淋巴结炎性细胞浸润。感染仔猪组织脏器病毒载量检测显示,病毒主要定植在肠道、肺脏和淋巴组织。荧光定量PCR对外周血中相关细胞因子水平检测,攻毒初期IL-1α、IL-6细胞因子上升明显,后期IL-2水平升高较快;抗病毒因子MX1水平持续上高,在14 d左右达到高峰。结果表明,PSV感染低日龄仔猪可引起腹泻,甚至死亡;病毒定植部位以肠道、肺脏及淋巴组织为主;感染后能诱导仔猪机体产生高水平细胞因子及抗病毒因子,攻毒仔猪体内先诱导产生TH2型体液免疫反应为主的抗炎性反应为主,后期以诱导TH1型促炎症反应的免疫应答为主。     

猪萨佩罗病毒对不同日龄猪的致病性

猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)是可引起仔猪腹泻、肺炎、繁殖障碍和脑脊髓灰质炎等临床症状的肠道病毒,在腹泻猪和无症状的猪中均可检测到,在我国多地流行,给养猪业造成巨大的经济损失。前期本实验室从仔猪腹泻粪便样品中分离到1株PSV,为探究其对不同日龄猪的致病作用,本研究用相同剂量的PSV分别感染3日龄和2月龄猪。结果表明攻毒后24 h, 3日龄猪出现明显的临床症状(水样腹泻、震颤和食欲不振等),2月龄猪无明显的临床症状。攻毒3 d后,对所有猪进行剖检,qRT-PCR结果表明,3日龄猪和2月龄猪粪便中病毒含量均在攻毒后48 h到达顶峰,且PSV在3日龄和2月龄猪体内均具有广泛的组织嗜性。组织病理学检查结果表明PSV感染3日龄猪只后,可引起明显的肠道病理变化,主要表现为肠绒毛萎缩、脱落等,而2月龄猪肠道无明显的病理变化。综上所述,PSV可感染3日龄和2月龄猪,且可以在体内高效复制,但仅引起3日龄猪发生明显的临床症状,对2月龄猪无明显的致病性。     

猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用简

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）检测方法,试验据GenBank中PEDV基因组序列,设计并合成针对M基因的内、外2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示,单一使用外引物或内引物进行常规RT-PCR时检测限量均为50 pg PEDV RNA模板,而使用巢式RT-PCR可检测到50 fg PEDV RNA模板。使用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。结果表明,建立的巢式RT-PCR方法特异性、敏感性好,可快速准确地检测出样本中微量PEDV核酸。