6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。     

猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

根据猪流行性腹泻病毒S基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从广东省某猪场采集的初生仔猪腹泻样品检测猪流行性腹泻病毒,并将其克隆测序分析。结果表明,病料样品中有猪流行性腹泻病毒,S基因与KNU-0801、KNU-0901亲缘关系最近,处于同一个分支;与弱毒疫苗株CV777的S基因亲缘关系较远,处于另外一个分支。     

猪流行性腹泻病毒CH/JLDH/2016株分离鉴定及S基因序列分析

为了研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的变异情况,试验采用分离病毒时添加胰蛋白酶的方法,从病死仔猪肠组织中成功分离鉴定出1株PEDV变异毒株,命名为CH/JLDH/2016,应用纳米巢式PCR法鉴定分离株,电镜负染观察,并对该分离株S基因序列特征和遗传进化关系进行分析。结果表明:经纳米巢式PCR扩增得到目的条带;在透射电子显微镜下可观察到完整的病毒粒子,具有冠状病毒典型结构;与现有疫苗株CV777相比,分离株S基因存在16处碱基的插入、10处碱基的缺失并伴有大量碱基突变,其推导的氨基酸序列存在5个氨基酸的插入和3个氨基酸的缺失;该分离株与疫苗株CV777处于不同分支,亲缘关系较远,而与近几年分离得到的PEDV变异毒株亲缘关系较近。说明PEDV呈现进化和变异趋势。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株M基因序列分析

为了研究山西地区猪流行性腹泻病毒M基因的遗传变异情况,从2014年10月~2015年4月山西地区11个地市收集的猪流行性腹泻病毒(PEDV)病料中扩增到4株PEDV的M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明,4株PEDV的M基因与CV777毒株比较,部分核苷酸及氨基酸发生改变。4株PEDV的M基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~99.6%,与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%~99.9%和96.0%~99.1%。遗传进化分析显示,4株PEDV与2010-2013年中国分离株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰国KU04RB08株亲缘关系较近;与2株泰国株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株欧洲株(CV777和Br1/87)和2006年中国分离株LZC亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒变异株XP2018的分离及S基因序列分析

本研究旨在从临床仔猪腹泻样品中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),并对其S基因进行测序分析.对腹泻仔猪小肠样品进行RT-PCR检测、病毒的分离培养、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定、S基因测序及遗传演化分析.结果显示:仔猪腹泻由流行性腹泻病毒引起;在Vero细胞上成功分离流行性腹泻病毒,命名为XP2018,该毒株细胞病变明...     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为了对疑似猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染病例进行确诊,并掌握致病原与其他流行毒株的基因差异性,试验采用病毒分离与细胞病变观察、PCR检测、中和试验、间接免疫荧光试验、S1基因序列分析等方法对该病例进行了研究。结果表明:临床病料接种Vero细胞盲传至18代后可产生典型的细胞病变,临床病料样品及各代次分离株病毒的PCR检测均为阳性,该毒株的TCID_(50)为1×10~(-6.61)/mL,该病毒可被PEDV阳性血清特异性中和,间接免疫荧光试验中可见明显的特异性绿色荧光,该病毒的S1基因核苷酸序列与GenBank中PEDV S1基因序列同源性在65.2%~100%之间,遗传进化关系中该病毒与近几年新分离株属于同一个大分支,与CV777等经典毒株亲缘关系较远。说明分离株病毒为国内近几年流行的新型PEDV。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其S基因序列分析

正猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。近年来研究表明,S基因是PEDV重要的毒力基因,影响着病毒的致病性。而不同国家和地区的流行毒株之间,S基因差异较大,不仅存在碱基位点的突变,还存在碱基的插入和缺失,特别是强弱毒株之间     

猪流行性腹泻病毒山西分离株S基因遗传变异分析

为分析山西地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,试验利用RT-PCR方法对2014-2015年山西省疑似猪流行性腹泻的阳性病料进行克隆和测序,获得4个S基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行比对分析。序列分析结果显示,4株PEDV山西分离株的S基因与CV777 vaccine相比,在170~171 bp之间插入12个核苷酸,在401~402、454~455 bp之间均插入3个核苷酸,在461~468 bp之间缺失6个核苷酸。4株PEDV山西分离株S基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%~99.8%和98.6%~99.7%,与2011-2015年中国流行毒株、CV777 vaccine、attenuated DR13、CV777的核苷酸同源性分别95.0%~98.5%、93.2%~93.6%、93.2%~93.7%、93.7%~94.4%,氨基酸同源性分别为96.2%~98.9%、91.9%~92.6%、92.1%~92.9%、92.9%~94.0%。遗传进化树分析结果表明,PEDV S基因分为3个群,4株PEDV山西分离株属于第一群,与2010年以后国内流行毒株（除AH-M、SQ2014）的亲缘关系较近,与2010年以前中国流行毒株、2个日本株、7个韩国株、2个疫苗株的亲缘关系较远。研究结果提示山西省流行的PEDV发生较明显的变异,需研发新的疫苗来控制PEDV的暴发。     

猪流行性腹泻病毒变异株GDqy2017的分离及S和ORF3基因序列分析

2017年广东某猪场送检腹泻死亡仔猪小肠样本,经实验室检测、细胞分离及RT-PCR鉴定,确定分离到1株猪流行性腹泻病毒,命名为GDqy2017,克隆并测定其S基因与ORF3基因序列,并对序列进行分析。结果显示,该分离株对Vero细胞高度适应,第1代即出现细胞病变(CPE),第4代起1d内即出现CPE,且CPE时间和形态稳定。其S基因长4 158nt,与经典毒株CV777、中国疫苗株CV777及韩国疫苗株attenuated DR13核苷酸同源性为94.2%、94.1%、94.2%,氨基酸同源性为93.4%、92.7%、93.0%,存在2处插入、2处缺失及98处突变(与经典毒株CV777相比),属于不同进化群,与国内2010年后参考株(除CHXBC-01-2015、CH/GDQY/2011)在同一进化群,S蛋白的主要抗原表位存在突变,其中有1处新突变出现(640位F→S),其ORF3全长675nt,不存在疫苗株中的大片段缺失及表达截短现像,但存在突变,进化树分析显示与经典毒株CV777、疫苗株属于不同进化群,亲缘关系较远。研究结果为后续PEDV分子生物学分析、流行病学调查及研制更为有效的疫苗提供基础数据。     

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其ORF3和S基因序列分析

为了探明辽宁省沈阳市某猪场仔猪发生腹泻的病原及其遗传进化特征,试验首先对该猪场发生腹泻的仔猪腹腔进行剖检,记录小肠组织的病理变化;收集病理变化较明显的组织进行切片和H.E.染色,观察并记录结果;取病料后提取病毒核酸,用猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪丁型冠状病毒(Porcine delta coronavirus, PDCoV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, PRoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)检测引物进行RT-PCR检测;然后进行病毒的分离、致细胞病变效应(CPE)观察、传代、间接免疫荧光试验与效价的测定;最后对病毒的关键基因进行PCR扩增及遗传进化分析。结果表明：腹泻仔猪小肠肠壁变薄、胀满、充满水样内容物,肠系膜呈树枝状充血,肠系膜淋巴结水肿;十二指肠肠绒毛破碎、细胞坏死,...     

沈阳地区1株猪流行性腹泻病毒S1基因序列测定与分析

利用PEDV的S1基因的特异性引物,克隆了沈阳地区1株PEDV流行毒株(LNSY-2017)的S1基因,并通过S1基因序列比对,分析了此病毒株与其他相关毒株的亲缘关系。结果显示:LNSY-2017株S1基因(2 372 bp)与我国疫苗株CV777(2 364 bp)相比,存在16个核苷酸的插入和8个核苷酸的缺失,导致推导的氨基酸序列存在6个氨基酸的插入(⁵⁶G、⁵⁹QGVN⁶²和⁶⁹G)和6个氨基酸的缺失(⁷³N、¹⁵⁷FA¹⁵⁸、³⁸⁰YL³⁸¹和⁵²¹G),且在2个主要中和抗体表位(aa499～637和aa763～770)有11处氨基酸的突变。遗传进化分析结果显示,LNSY-2017与主要的疫苗株同源性较低(91.4%～92.5%),而与2012年韩国毒株、美国2013年毒株以及中国近年来流行毒株同源性最高(97.0%～98.7%),属于基因G2b型。结果表明,沈阳地区的PEDV流行株已经发生很大变异,因此很有必要加强对PEDV变异的监测。     

猪流行性腹泻病毒X-6/2021株的分离鉴定及其S1基因序列分析

为了了解四川地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生物学特征及基因的遗传进化关系,从四川某地采集了发病仔猪小肠,病料处理后在Vero细胞上进行盲传,通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定（IFA）验证,成功分离出1株猪流行性腹泻病毒,命名为X-6/2021株。对X-6/2021株S1基因进行RT-PCR扩增,获得的分离株S1序列与国内外PEDV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%,与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%。试验成功地从四川省分离鉴定得到1株猪流行性腹泻病毒,为该地区PEDV防控及候选疫苗毒株的筛选提供了物质基础。     

猪流行性腹泻病毒云南省流行毒株S1基因序列分析

为深入了解云南省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的流行现状及现有疫苗株的保护效果,从2017—2022年云南省PEDV感染临床阳性样品中扩增出9份样品的PEDV S1基因,利用生物信息学方法,对9份样品S1基因进行了遗传进化树构建、同源性分析和氨基酸突变位点分析等。结果显示：2份样品位于G1基因群,其余7份位于G2基因群的G2b基因亚群。7份G2b基因亚群样品的核苷酸和推导氨基酸同源性较高,与G2基因群的AJ1102和L/W/L疫苗株处于不同基因亚群且同源性较低,并在第13、139、289和363位发生了不一致的突变位点;与现有疫苗株相比,在抗原中和位点COE区域以及其他区域,有明显的抗原性变化。结果表明：云南省存在G1基因群和G2b基因亚群PEDV同时流行,但以G2b基因亚群为主;流行株和疫苗株间存在较远的遗传和亲缘关系,以及氨基酸突变和抗原性差异,这很可能是导致目前PED控制不理想的原因,因此需要研发安全有效的疫苗。     

基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近，笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒（PEDV），为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行，对实验室2018-2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因（spike）分子特征研究。结果表明：腹泻样本的PEDV检出率为42.2%（49/116，95% CI=33.1%~51.8%），并获得了13条完整的S基因序列，全长为4 149~4 170 bp，序列相似性为94.2%~99.9%，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%~98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群，其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群；SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支，且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程，以贝叶斯进化分析软件包（BEAST）进行分歧时间估算，结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年，早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间（2015.7年）；SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年，早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年，所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV，并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川，为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近,笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒(PEDV),为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行,对实验室2018—2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因(spike)分子特征研究。结果表明:腹泻样本的PEDV检出率为42.2%(49/116,95%CI=33.1%～51.8%),并获得了13条完整的S基因序列,全长为4 149～4 170bp,序列相似性为94.2%～99.9%,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%～98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群;SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支,且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程,以贝叶斯进化分析软件包(BEAST)进行分歧时间估算,结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年,早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间(2015.7年);SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年,早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年,所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV,并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川,为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

3株临床分离的猪流行性腹泻病毒S基因克隆及序列分析

对临床分离鉴定的3株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆及序列分析,对丰富我国PEDV的遗传衍化特征具有重要意义。S基因序列分析发现,JX18毒株与CV777亲缘关系较近,核苷酸同源性为99.71%,氨基酸同源性95.7%,属于G1-b进化分支。JX18毒株与CV777经典毒株S蛋白氨基酸序列相比较,不存在氨基酸的插入或缺失,在中和表位区及已鉴定抗原表位区仅有一处氨基酸突变。SD18、JingTai18与PEDV CV777亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为93.64%和92.64%,S蛋白氨基酸序列同源性分别为93%和93.5%。SD18和JingTai18位于G2-b进化分支。SD18与JingTai18株与CV777经典毒株相比,S蛋白氨基酸序列中存在插入缺失及多位点的氨基酸突变。研究结果为进一步了解我国PEDV流行及变异情况提供了数据支持。     

2012年河南省猪流行性腹泻病毒分离株S1基因遗传变异分析

We designed and synthesized two pairs of specific primers amplified S1 gene by RT-PCR method to investigate the variation in S1 genes of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in 2012 in Henan.S1 genes of 5 PEDV strains were cloned and sequenced, and their phylogenetic trees were analyzed from different swine breeding farms. Sequences analysis showed that S1 genes shared 98.3% to 99.5% nucleotide identities and 97.1% to 98.9% amino acids homologies among five PEDV isolates. Compared with domestic landing PEDV from 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 98.0% and amino acid homologies were 85.3% to 98.7%. Compared with CV777, the nucleotide homologies were 88.7% to 89.1% and amino acid homologies were 87.3% to 88.4%. Homology analysis showed that S1 genes of 5 isolates shared the same genetic mutation, there were the same insertions and deletions. Compared with domestic mutant strains landed from 2011, there was no tendency. However, compared with CV777, there were three nucleotide insertions from 163 to 166 bp, nine nucleotide insertions from 173 to 174 bp, three nucleotide insertions from 405 to 406 bp and three nucleotide deletions from 463 to 464 bp. These insertions and deletions of nucleotides led to its corresponding changes in encoding amino acids. Phylogenetic analysis showed that S1 genes of 5 PEDV strains belonged to the third group. However compared with part of PEDV first group domestic mutant strains landed in 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 89.3% and amino acid homologies were 85.3% to 86.9%. CV777 was the second group. The results showed that S1 genes of PEDV prevalent strain exist in first and third groups, but mainly prevailing third group strains, the pathogenic and antigenic differences of these strains should be further studied.     

10株猪流行性腹泻病毒云南分离株的S基因克隆及分子特征

自2013年来,猪流行性腹泻病(PED)的暴发给云南省养猪业带来严重的经济损失。本研究对2018年来自云南4个地区的42份病料中分离出的6株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的部分S基因进行扩增,并结合在2013年所分离到的来自云南4个地区的4株PEDV流行株,进行分子特征和遗传进化分析。结果显示:这2年的分离株和CV777株相比,2018年分离株的核苷酸和氨基酸突变位点增加了12个和7个,且有3个丝氨酸突变都是在COE结构域(69、101和146)。系统发育分析表明,2018和2013年分离株的核苷酸和氨基酸的同源性为95.6%～98.8%,95%～98.8%;分别与CV777株相比,核苷酸和氨基酸的同源性差异较小(94.9%～95.5%和92.7%～95.4%;94.5%～95.2%和93.4%～94.2%),亲缘关系都较远。2013年的分离株主要分布在G2b亚群,而2018年的分离株主要分布在G2a和G2c亚群,具有遗传多样性。N-糖基化和磷酸化位点预测分析显示,在216位上预测的N-糖基化位点由NSSI→NSSF,尤其是COE结构域中的丝氨酸取代而导致其可预测磷酸化。这些变异很可能会影响其抗原性和疫苗效果,导致PEDV控制效果不好。本研究阐明了云南部分地区PEDV流行毒株的分子流行病学和遗传特征,为该地区PED的防控奠定理论基础。