霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶,其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和cGAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使,通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备cdi-GMP用于深入研究其功能,构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体,并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。利用丙酸钠诱导表达后,观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质,获得的重组蛋白质进行体外酶促反应,高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明:成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法;c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。     

线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone对湖羊冻精损伤的保护作用

旨在研究线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone (MitoQ)对湖羊冷冻精子的保护作用。本研究选择健康的成年种公羊精液,将其分成6等份。不含MitoQ者设为对照组(M0),M1、M2、M3、M4和M5组分别为含50、100、150、200和400 nmol·L~(-1)MitoQ的添加组。精子经冷冻解冻后检测活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性等精子质量指标,同时进行超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)等抗氧化指标检测。结果表明,当MitoQ添加的浓度为150 nmol·L~(-1)(M3组)时,其解冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高,分别达55.00%、52.34%、48.32%、54.51%和51.28%,其线粒体活性显著高于其他组(P0.05)。M3组解冻后精子的SOD和GSH-Px值分别为203.90 U·mL~(-1)和123.62 U·L~(-1),两者均显著高于M0、M1、M4和M5组(P0.05);M3组解冻后精子的ROS和MDA值分别为298.34 U·mL~(-1)和4.99 nmol·L~(-1),显著低于其他组(P0.05)。当MitoQ的添加浓度提高至200(M4组)和400 nmol·L~(-1)(M5组)时,冻精质量开始下降,并表现为对精子的氧化损伤。在湖羊冷冻精液中,添加150 nmol·L~(-1)的MitoQ可显著降低精子氧化损伤,提高冻精品质,当MitoQ的添加浓度超过200 nmol·L~(-1)时对冷冻精子没有保护作用。     

青海牦牛卵巢颗粒细胞体外培养及kisspeptin-10对其孕酮分泌的影响和机制研究

体外培养牦牛卵巢颗粒细胞,并研究Kisspeptin-10对其孕酮分泌的作用和可能机制。于屠宰场选取适宜卵巢后在4h内运回实验室,抽吸法提取细胞,并通过卵泡刺激素受体(FSHR)抗体验证培养的颗粒细胞纯度,HE染色观察细胞形态,CCK测细胞生长曲线;不同浓度的Kisspeptin-10、Verapamil单独或共同处理细胞24 h后,分别收集细胞和上清,通过流式细胞仪检测细胞内Ca~(2+)浓度,ELLSA测上清内孕酮含量。结果显示,FSHR阳性率>97%,验证了细胞为卵巢颗粒细胞;使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养液培养,可获得生长良好的牦牛卵巢颗粒细胞。颗粒细胞呈多角形或梭形,并伸出伪足,呈放射状生长。培养24 h后,颗粒细胞进入对数生长期,于72 h后进入平台期;Kisspeptin-10处理可显著增加颗粒细胞的活力,100 nmol·L~(-1)时可显著促进孕酮的分泌;钙离子阻断剂Verapamil会降低孕酮的分泌,于20、50 nmol·L~(-1)时,达显著降低水平(P<0.05);100 nmol·L~(-1) Kisspeptin-10与不同浓度的Verapamil共同处理时,孕酮含量有所提升,但不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用(P>0.05);流式细胞仪检测胞内Ca~(2+)浓度,其结果与检测的颗粒细胞孕酮分泌水平相一致。综上,Kisspeptin-10能促进体外培养的牦牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌,其机制可能与胞内Ca~(2+)浓度相关。     

猫杯状病毒RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法的建立及初步应用

为建立猫杯状病毒(FCV)基于重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)结合CRISPR-Cas12a系统及侧向流层析试纸条(LFS)(RAA-CRISPR/Cas12a-LFS)的快速检测的方法，本研究基于FCV衣壳蛋白(VP1)基因序列保守区设计RAA引物、4对针对VP1靶标的扩增引物、4对VP1-cr RNA扩增引物和1条报告探针。利用4对VP1-crRNA扩增引物经退火和T7 RNA聚合酶转录合成4条靶标crRNA:VP1-1/2/3/4-crRNA，利用4对VP1靶标扩增引物经退火合成4条靶标双链DNA:VP1-1/2/3/4，经EnGen^?Lba Cas12a (Cpf1)核酸酶试剂的切割反应和Cas12a试纸条检测，根据出现条带的强弱筛选最佳VP1-crRNA。结果显示，VP1-2-crRNA对应的T线条带最强且C线不完全切割的条带最弱。因此选择VP1-2-crRNA进行后续试验。分别以FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA为模板，利用RAA引物扩增其VP1基因，并通过琼脂糖凝胶电泳检测并评估RAA引物的扩增效果；利用Cas12a (Cpf1)核酸...     

病毒性神经坏死病病毒核酸检测用标准物质的制备

利用基因克隆和体外转录技术,制备病毒性神经坏死病病毒(Nervous necrosis virus,NNV)核酸检测标准物质。设计NNV RNA2基因的特异性引物,通过RT-PCR获得目的片段并连接至p GEM-T载体;采用体外转录方法,获得大量纯品RNA。初步定量稀释至约10~8 copies/μL,均匀性检验结果显示样品间差异5%;稳定性检验表明,室温(20~25℃)保存7 d、冷藏(2~8℃)保存1个月和冷冻(-20℃)保存6个月的含量均无明显变化。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法,对转录的RNA片段进行定值,并根据委托单位的定值结果进行不确定度估算。核酸标准物质定值为(8.452±0.068)×10~8 copies/μL,可用作NNV核酸检测的标准质控品。     

血清对猪前脂肪细胞分化过程中聚脂相关基因表达的影响

为了探讨血清对猪前脂肪细胞诱导分化的影响,筛选更优的诱导方法.采用胶原酶消化法分离猪皮下前脂肪细胞,用含50 nmol·L~(-1)胰岛素、100 nmol·L~(-1)地塞米松、0.25 mmol·L~(-1)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100nmol·L~1罗格列酮及添加(对照组)或不添加(试验组)10%FBS的分化培养液1和2对前脂肪细胞进行诱导分化,借助实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因PPARα、C/EBPα、FASN、ACOX1、GPAT和ENPP2的表达模式.结果显示:血清对PPARγ和FABP4两基因的表达有极显著的上调作用(P<＜0.01),而对其他6个基因的表达有极显著的下调作用(P＜0.01).试验组中FASN、GPAT和ACOX13个基因诱导分化各时间点的综合表达景均极显著高于对照组(P＜0.01),3基因表达量变化趋势间均达到极显著相关(P＜0.01).试验组中PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX1 4个基因的基因表达最变化趋势间均达到显著或极显著正相关.研究表明:前脂肪细胞分化过程中,细胞内脂肪酸的生物合成和β氧化均在发生,细胞内脂肪含量积聚的快慢取决于2个途径力量的对比;PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX14个基因间存在极强的协同表达现象;在细胞内脂肪积聚快慢上,含血清的分化培养液1要优于不含血清的分化培养液2.     

谷胱甘肽促进牛体外受精胚胎发育的转录组初探

旨在探究牛体外受精胚胎的培养液中添加3mmol·L~(-1)谷胱甘肽(Glutathione,GSH)后,8~16-细胞期和桑椹期的牛体外胚胎在转录组水平上的变化。收集8~16-细胞期和桑椹期的体外受精胚胎,构建文库,通过Illumina平台进行测序;筛选差异基因,并进行功能注释和代谢途径分析;采用定量PCR对10个基因的表达水平进行检测,以验证测序结果的准确性;在获得的新转录本中挑选3组进行RNA和蛋白结构的预测。通过OOSP1、THAP9等10个基因的定量检测、测序结果的质量评价(碱基错误率、Q20、Q30、GC含量)、reads与牛基因组的比对及其在基因组的分布统计分析,均说明该测序结果准确、可靠。测序获得差异表达基因4 100个(其中,处理组8~16-细胞期胚胎和桑椹胚中3 952个,对照组中884个),已知基因2 225个,未知基因1 875个。这些差异基因主要富集到与ATP合成、呼吸链、DNA合成、翻译过程和物质代谢相关的84条GO terms上,参与细胞黏附、柠檬酸循环、谷胱甘肽代谢、溶酶体以及氨基酸代谢等27条通路。另外,与已知的转录本相比,5个新转录本中均发现不同长度的新外显子;预测的蛋白结构中除包含各自的保守结构域(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的催化结构域、MAD同源结构域)外,还发现2个新的蛋白结构域(低复杂区、dwarfins蛋白家族B结构域)。综上表明,在培养液中添加GSH能导致胚胎转录谱的变化,显著提高胚胎的体外发育能力。     

伏马毒素B_1适配体的筛选及其快速定量检测方法的建立

本研究旨在获得伏马毒素B1特异性适配体并利用其和胶体金的作用建立伏马毒素B1的快速检测方法。通过非固定靶标的指数富集配体系统进化技术筛选获得伏马毒素B1的适配体,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定所获适配体的亲和力和特异性,建立基于适配体的胶体金快速定量检测方法。结果表明:筛选得到的伏马毒素B1适配体F102亲和力解离常数为(42.1±4.0)nmol/L;建立的胶体金检测方法简便、快速、特异性强;样品检测结果与液相色谱结果的相对误差低于15.7%。因此,本研究利用筛选得到的适配体建立了可用于谷物和饲料中伏马毒素B1含量的快速定量检测方法。     

伏马毒素B_1适配体的筛选及其快速定量检测方法的建立北大核心CSCD

本研究旨在获得伏马毒素B1特异性适配体并利用其和胶体金的作用建立伏马毒素B1的快速检测方法。通过非固定靶标的指数富集配体系统进化技术筛选获得伏马毒素B1的适配体,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定所获适配体的亲和力和特异性,建立基于适配体的胶体金快速定量检测方法。结果表明:筛选得到的伏马毒素B1适配体F102亲和力解离常数为(42.1±4.0)nmol/L;建立的胶体金检测方法简便、快速、特异性强;样品检测结果与液相色谱结果的相对误差低于15.7%。因此,本研究利用筛选得到的适配体建立了可用于谷物和饲料中伏马毒素B1含量的快速定量检测方法。     

托芬那酸注射液在犬体内的生物等效性研究

为研究国产和进口托芬那酸注射液在犬体内的药代动力学和生物等效性,采用双处理、双周期随机交叉试验设计,将20头健康比格犬随机分成2组,按0.1 m L/kg体重肌肉分别单剂量注射受试制剂和参比制剂,采用高效液相色谱法测定血浆中托芬那酸的浓度,利用WinNonlin6.3软件计算主要药动学参数,并评价两种制剂的生物等效性。结果显示,受试制剂和参比制剂的Tmax分别为(0.2±0.1)h和(0.3±0.2)h;Cmax分别为(5.12±1.55)μg/m L和(5.38±2.04)μg/m L;AUC0-t分别为(12.1±2.97)μg·h·m L~(-1)和(12.28±3.24)μg·h·m L~(-1);AUC_(0-∞)分别为(13.38±3.10)μg·h·m L~(-1)和(13.85±3.40)μg·h·m L~(-1)。托芬那酸注射液受试制剂和参比制剂的AUC_(0-t)、AUC_(0-∞)、C_(max)、T_(max)均无显著性差异(P0.05)。双单侧t检验结果显示两种制剂生物等效,临床上可相互替代。该试验为兽医临床给药方案的制定以及合理用药提供参考。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对牛冷冻精液品质及受精能力的影响

本试验旨在探究牛冷冻-解冻精液中添加不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对精液品质及受精能力的影响。在牛冷冻-解冻精液中添加不同浓度(0、5、10和20μmol·L~(-1))EGCG,38.5℃孵育1h后,检测精子动力学参数、结构完整性、精子中相关酶活力和体外受精能力。结果表明,10μmol·L~(-1)EGCG处理显著提高了精子活力(TM,%)和鞭打频率(BCF,Hz,P0.05);与对照组相比,5、10和20μmol·L~(-1)EGCG处理组精子质膜和顶体完整率显著升高(P0.05);5和10μmol·L~(-1 )EGCG处理组精子线粒体膜完整率显著升高(P0.05);10和20μmol·L~(-1 )EGCG处理能够显著提高精子中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,10μmol·L~(-1 )EGCG处理降低乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)含量(P0.05);10和20μmol·L~(-1 )EGCG处理显著提高了精子受精后早期胚胎卵裂率和囊胚率(P0.05)。综上表明,10μmol·L~(-1)EGCG处理牛冷冻-解冻精液能提高精液品质及受精能力。     

猫细小病毒适配体的筛选与鉴定

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。     

葡萄糖对绒山羊精子冷冻保存及代谢的影响

旨在研究葡萄糖对绒山羊精子冷冻保存及代谢的影响。本研究将混合后的精液样品,在含有不同浓度葡萄糖(0、28、56、84和112mmol·L~(-1))的冷冻稀释液进行冷冻-解冻,利用计算机辅助精液分析系统(CASAS)、流式细胞仪和酶标仪检测精子的运动性能、精子DNA完整性、顶体完整性、质膜完整性和精子中ROS和Ca2+水平,以及精子中ATP浓度、精子悬浮液中乳酸和丙酮酸浓度。结果表明,在冷冻稀释液中添加56mmol·L~(-1)葡萄糖可以显著提高绒山羊精子冷冻-解冻后的精子活力、完整顶体和完整质膜的精子比率(P0.05),但各组间完整DNA的精子比率差异不显著(P0.05)。56mmol·L~(-1)葡萄糖组精子细胞中ROS水平极显著高于其它各组(P0.01);28和56mmol·L~(-1)葡萄糖组精子细胞中Ca2+水平极显著低于其它各组(P0.01);与其它各组相比,56和84mmol·L~(-1)葡萄糖组精子细胞中ATP浓度极显著升高(P0.01)。精液解冻后,在低葡萄糖浓度组(28~56mmol·L~(-1))的精子悬浮液中未检测到乳酸,而112mmol·L~(-1)组检测到大量乳酸(P0.01);当冷冻稀释液中添加低浓度的葡萄糖(28~84mmol·L~(-1)),葡萄糖对精子悬浮液中丙酮酸的产生存在剂量依赖性作用,而高浓度(112mmol·L~(-1))组中丙酮酸产生减少(P0.05)。综上表明,在冷冻稀释液中添加56mmol·L~(-1)葡萄糖可以促进绒山羊精子冷冻-解冻过程中的代谢,提高其冷冻保存效果。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞脂合成作用的影响

为确定胰岛素(insulin,INS)和胰高血糖素(glucagon,GLN)对奶牛肝细胞脂合成作用的影响,本试验体外培养犊牛原代肝细胞,分别用不同浓度的INS和GLN处理肝细胞:对照组(0nmol/L)、浓度梯度组(1,10,100,1 000nmol/L)。培养1h后分别用免疫印迹(Western blot,WB)方法、荧光定量PCR(qRT-PCR)方法以及细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测INS和GLN处理体外培养肝细胞对关键转录因子固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)mRNA表达水平,SREBP-1c核质分布以及下游靶基因脂代谢关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达水平的影响。结果显示:INS处理使SREBP-1c的表达水平和转录活性显著升高,入核量显著增加,其下游的脂合成关键酶ACC和FAS的基因表达水平也显著升高。而与之相反,GLN处理使SREBP-1c的表达水平和转录活性显著降低,入核量显著减少,其下游的脂合成关键酶ACC和FAS的基因表达水平也显著降低。以上结果说明,INS可通过增强SREBP-1c的活性从而促进肝细胞脂合成,增加肝脂沉积;而GLN则通过抑制SREBP-1c的活性从而降低肝细胞脂合成。     

体外成熟液中添加PAF对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达的影响

旨在探讨体外成熟(IVM)液中添加血小板活化因子(PAF)对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达影响。本试验将牦牛1 025个卵丘-卵母细胞复合体(COCs)分为4组,分别在含不同浓度PAF(0、10~(-8)、10~(-7)和10~(-6)mol·L~(-1))的IVM液中成熟后,与奶牛精子体外受精(IVF)和体外培养(IVC),比较分析各组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率以及COCs和胚胎中抗凋亡(BCL-2)、促凋亡(BAX)、表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)、转录因子(OCT-4和NANOG)和c-fos等基因的表达量差异。结果表明,IVM液中PAF浓度为10~(-7)mol·L~(-1)组的卵母细胞成熟率((92.16±0.19)%)、卵裂率((77.20±0.85)%)和囊胚率((46.71±0.68)%)显著高于其他组(P0.05)。qPCR结果显示,在该组成熟的COCs中BCL-2、EGF、EGFR、c-fos表达量显著上调(P0.05),而促凋亡基因BAX表达量显著下调(P0.05),囊胚中EGF、EGFR、OCT-4基因表达量显著上调(P0.05)。各组间2-、4-、8-细胞、桑椹胚和囊胚中BCL-2、BAX和NANOG表达量差异不显著,但桑椹胚和囊胚中BCL-2表达量均明显下调,而BAX表达量均明显上调。综上所述,IVM液中适宜浓度PAF(10~(-7)mol·L~(-1))可以促进牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育,调控细胞凋亡和增殖相关基因的表达。     

柳芽粗多糖超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性分析

为了优化柳芽粗多糖(crude polysaccharide of willow bud,CPW)提取工艺并考察其体外抗氧化活性,试验采用超声辅助水提醇沉法提取柳芽粗多糖,并运用响应面分析法进行优化;以维生素C(vitamin C,VC)为对照,通过比色法检测其总抗氧化能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基(DPPH·)以及抑制超氧阴离子自由基(O₂^-·)和羟自由基(·OH)的能力,评价CPW体外抗氧化效果。结果表明：CPW最佳提取工艺为液料比70∶1(mL/g),水浴温度56℃,超声功率440 W;采用该提取工艺对CPW的提取率达到6.6%。不同浓度CPW能够有效清除DPPH·和抑制·OH和O₂^-·的产生。说明优化的CPW超声辅助提取工艺切实可行,且所提取的CPW抗氧化能力较好。     

铁线莲‘Blekitny Aniol’组织培养及再生体系建立

对铁线莲(Clematis florida‘Blekitny Aniol’)的带芽茎段进行诱导产生无菌苗,并对其叶片和茎段进行愈伤组织诱导成苗的分化研究,成功建立了铁线莲组织培养再生体系。结果表明,带芽茎段诱导腋芽最佳培养基为MS+1mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)NAA,腋芽萌发率为100.0%;茎段诱导愈伤最适宜培养基为MS+2 mg·L~(-1)6-BA+0.01mg·L~(-1)NAA,诱导率为78.3%;叶片诱导愈伤组织最适宜的培养基为MS+1 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA,诱导率为81.7%;愈伤组织分化的最佳培养基为1/2MS+1 mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)NAA,分化率可达25.0%;最适宜不定芽的增殖培养基为1/2MS+3 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA,增殖倍数为4.94;筛选出最优的生根培养基组合为1/2MS+0.05 mg·L~(-1)NAA,生根率为70.2%。本研究将为铁线莲的推广应用提供参考,也为其他铁线莲属植物引种和开发利用奠定了基础。     

红三叶根际溶磷菌的筛选与培养基优化

为从岷山红三叶根际土壤中筛选出大量高效溶磷菌株,本研究采用Pikovaskaia’s、PKOC1和PKOC2三种溶磷培养基进行溶磷菌株的初步筛选和优良溶磷菌株16SrRNA基因序列鉴定,并对分离筛选效果较好的PKOC2培养基进行响应面优化。结果表明:采用Pikovaskaia’s、PKOC1和PKOC2三种溶磷培养基,从红三叶根际分离出26株溶磷菌株;经16SrRNA基因序列对7株优良溶磷菌株进行初步比对鉴定,初步鉴定结果为:菌株MHS4为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus);菌株MHS7和MHS19为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis);菌株MHS27为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis);菌株MHS30为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens);菌株MHS31为盖氏假单胞菌(Pseudomonas gessardii);菌株MHS49为产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。PKOC2溶磷培养基优化配方为:葡萄糖18.19g·L~(-1),Ca_3(PO_4)25g·L~(-1),MgCl2·6H_2O 3.21g·L~(-1),MgSO_4·7H_2O 0.25g·L~(-1),KCl 0.2g·L~(-1),(NH_4)_2SO_40.08g·L~(-1)。红三叶根际溶磷菌资源丰富,优化后的溶磷培养基为高效溶磷菌资源筛选提供资源支持。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养

本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞(腺上皮细胞和基质细胞)和平滑肌细胞,并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法。用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞,分别在添加20%胎牛血清(FBS)、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L雌二醇(E2)、7.14nmol/L孕酮(P4)的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2的饱和湿度条件下培养;用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度。结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞,且2种细胞纯度都达98%左右,基质细胞出现蜕膜化;子宫平滑肌细胞的纯度为97%左右,而且出现横纹状的生长。本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养;在含20?S、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L E2、7.14 nmol/L P4的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长。     

GA_3和6-BA对高加索三叶草根蘖芽生长及内源激素含量的影响

为了研究植物生长调节剂赤霉素(GA_3)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)对高加索三叶草根蘖芽生长发育及内源激素含量的影响,在不同浓度的GA_3(0对照、300、600、900和1200 mg·L~(-1))和6-BA(0对照、25、50、100和200 mg·L~(-1)),对其根蘖芽生长后的植株高度、叶片数、叶绿素含量和内源激素含量(地上部分和地下部分)进行测定与分析。结果表明:与对照相比,所有GA_3处理均显著增加了株高(P0.05)。尤其在600 mg·L~(-1) GA_3处理下,平均株高为21.33 cm(高于对照处理4.12倍)。GA_3还促进了叶绿素a的合成,最显著效果是在600 mg·L~(-1) GA_3处理下,叶绿素a的浓度为0.92 mg·g~(-1)(高于对照76.92%)(P0.05)。GA_3对叶绿素b含量无显著影响(P0.05)。在6-BA所有处理浓度下,株高约为对照处理2.6倍,并且对于叶片数,6-BA处理比GA_3处理更敏感,在200 mg·L~(-1)时最多,高于对照2.99倍。6-BA显著促进了叶绿素a和b的积累(P0.05)。内源激素含量在整个处理浓度下均显示出对外源激素应用的剂量反应。对于地上植物部分,600 mg·L~(-1)的外源GA_3引起内源玉米素(ZT),GA_3和生长素(IAA)分别增加约23.84%,55.71%和137.99%,而脱落酸(ABA)减少约44.09%。与对照相比,外源200 mg·L~(-1) 6-BA使内源ZT,GA_3和IAA含量分别提高了约293.23%,49.71%和49.84%,而ABA降低了约52.48%。对于地下植物部分,内源激素变化与地上部分植物的响应大致相似,明显不同在于外源同样浓度GA_3(600 mg·L~(-1))和6-BA(200 mg·L~(-1))处理引起的ABA降低要少(分别为15.15%和28.26%)。总之,600 mg·L~(-1) GA_3和200 mg·L~(-1) 6-BA是促高加索生长发育的最佳浓度。