绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

奶牛黏附分子MadCam-1基因的克隆及原核表达

原核表达MadCam-1基因、纯化MadCam-1黏附蛋白,并制备其多克隆抗体,为进一步功能研究奠定基础。根据MadCam-1的已知基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术扩增MadCam-1基因片段插入到原核表达载体 pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒 pGEX-4T-1-MadCam-1,转化入E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,以纯化后的融合蛋白为抗原,免疫家兔,获得抗血清。结果表明,重组表达质粒pGEX-4T-1-MadCam-1经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%。表达产物经Western blotting鉴定,结果证实成功表达了分子质量约为50 ku 的蛋白质。纯化的蛋白质免疫家兔后,经ELISA检测多克隆抗体效价为1∶32000。因此,成功获得了奶牛 MadCam-1多克隆抗体,为进一步研究奶牛黏附分子 MadCam-1的功能奠定了基础。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

牛源致病性大肠杆菌floR基因的克隆、表达及其抗体的制备

将耐氟苯尼考大肠杆菌的floR基因部分基因片段插入pGEX-4T-2原核表达载体中,构建以BL21（DE3）Codon Plus为宿主菌的原核表达体系。通过优化诱导条件,确定了floR1基因能在pGEX/BL21（DE3）codon plus中高效表达,且表达的重组蛋白为包涵体形式。对包涵体进行溶解复性后,将复性融合蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-FloR1融合蛋白。并以GST-FloR1融合蛋白为抗原免疫小鼠,成功制备出抗GST-FloR1融合蛋白的抗体。抗体的制备为FloR蛋白定位及其对氟苯尼考药物泵出功能抑制的研究奠定了基础。     

中国斗鸡DJ-1基因克隆与原核、真核表达研究

本研究以中国斗鸡λ噬菌体cDNA文库为模板,克隆了DJ-1基因,并构建了pGEX-4T-1-DJ-1原核表达载体和pEGFP-N3-DJ-1真核表达载体,前者用来研究DJ-1蛋白在大肠杆菌表达系统中的优化表达;后者用来转染成纤维细胞系,研究DJ-1蛋白的亚细胞定位和建立转DJ-1基因的细胞模型。试验成功克隆了DJ-1基因的CDS区,并将其定向插入到pGEX-4T-1原核表达载体和pEGFP-N3真核表达载体中。IPTG浓度梯度诱导原核表达结果显示,在0.8mmol/L时DJ-1蛋白表达量最高;时间梯度结果显示,在8h时DJ-1蛋白表达量最高;真核表达载体转染脂尾羊成纤维细胞后48h阳性率最高,DJ-1蛋白在细胞核和胞质中均有表达,但胞质中居多。上述结果表明,本试验已经建立了稳定的DJ-1蛋白的真核、原核优化的表达系统,为进一步研究DJ-1基因的功能奠定了基础。     

结核分支杆菌Rv3117基因的克隆与原核表达

以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。     

中国斗鸡DJ-1基因克隆与原核、真核表达研究

本研究以中国斗鸡λ噬菌体cDNA文库为模板,克隆了DJ-1基因,并构建了pGEX-4T-1-DJ-1原核表达载体和pEGFP-N3-DJ-1真核表达载体,前者用来研究DJ-1蛋白在大肠杆菌表达系统中的优化表达;后者用来转染成纤维细胞系,研究DJ-1蛋白的亚细胞定位和建立转DJ-1基因的细胞模型。试验成功克隆了DJ-1基因的CDS区,并将其定向插入到pGEX-4T-1原核表达载体和pEGFP-N3真核表达载体中。IPTG浓度梯度诱导原核表达结果显示,在0.8 mmol/L时DJ-1蛋白表达量最高;时间梯度结果显示,在8 h时DJ-1蛋白表达量最高;真核表达载体转染脂尾羊成纤维细胞后48 h阳性率最高,DJ-1蛋白在细胞核和胞质中均有表达,但胞质中居多。上述结果表明,本试验已经建立了稳定的DJ-1蛋白的真核、原核优化的表达系统,为进一步研究DJ-1基因的功能奠定了基础。     

猪生长分化因子11的原核表达及抗体制备

本研究旨在获得猪GDF-11的特异性抗体,以便于进一步研究猪GDF-11的功能.对猪GDF-11的编码区进行了克隆、表达载体的构建和转化、原核诱导表达和纯化以及将GDF-11注射到小鼠中并分离抗体.从猪胚肾中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到猪GDF-11基因的编码区,插入pMD18-T载体中.再经限制性内切酶BarnH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,将回收的GDF-11酶切片段插入原核表达载体pGEX-4T-2中,获得重组原核表达质粒pGEX-4T-2-GDF-11.重组质粒经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导产生了65 ku的GST-GDF-11融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切,分离纯化出42 ku左右的GDF-11蛋白;然后注射小鼠,制备了多克隆抗体,其滴度最高可达1:25 600,而且特异性好,表明得到了猪GDF-11的多克隆抗体.     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。     

蜜蜂幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因的原核表达及多克隆抗体的制备

克隆蜜蜂幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因PLMP,构建其原核表达载体后进行重组蛋白的表达及纯化,接种公兔制备多克隆抗体,以期为研究幼虫芽胞杆菌快速检测方法奠定基础。用PCR方法扩增幼虫芽胞杆菌PLMP基因,扩增产物克隆至表达载体pGEX-4T-1并转化至E.coliBL21(DE3)感受态中。经不同的诱导时间、IPTG浓度诱导表达PLMP重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。用目的蛋白对公兔进行4次免疫后,采集血清制备多抗。PCR扩增得到1 242bp的PLMP基因片段;构建原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP,经终浓度0.8mmol/L IPTG、37℃诱导表达5h得到分子质量为70ku目的蛋白;用目的蛋白免疫公兔得到的多抗经间接ELISA检测效价达到1∶12 800,Western blot检测出现条带,证明所制备的多抗能够用于PLMP抗原的检测。研究结果构建了表达幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因PLMP的原核载体,获得了PLMP蛋白,制备了兔抗PLMP多克隆抗体,为建立幼虫芽胞杆菌快速检测方法奠定了基础。     

鸡PPAR-γ基因表达载体构建及抗血清制备

为构建鸡PPAR-γ基因的原核和真核表达载体并制备鸡PPAR-γ的抗血清,根据鸡PPAR-γ基因cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR的方法扩增鸡PPAR-γ基因的cDNA片段并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3中;进而诱导重组原核表达载体pGEX-4T-1/PPAR-γ在大肠杆菌BL21中表达;同时利用重组真核表达载体pcDNA3/PPAR-γ免疫注射小鼠使其产生免疫应答。SDS-PAGE结果显示pGEX-4T-1/PPAR-γ在大肠杆菌BL21中得到了高效的表达。ELISA和Western blot结果表明,pcDNA3/PPAR-γ免疫小鼠产生了效价较高和特异性较强的抗体。本研究所构建的真核表达载体pcDNA3/PPAR-γ为在细胞水平上研究鸡PPAR-γ基因超表达提供了有力的工具;所获得的重组蛋白和抗血清为在蛋白水平上研究鸡PPAR-γ基因的功能奠定了基础。     

E种肠道病毒HY12毒株非结构蛋白3C单克隆抗体的制备与鉴定

为了研究国内分离的首株E种肠道病毒HY12毒株的非结构蛋白3C的功能,本研究以设计合成非结构蛋白3C的特异性引物,PCR扩增出3C的基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒.将构建的阳性质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,以IPTG诱导表达3C重组蛋白及应用尿素纯化包涵体的方法纯化重组蛋白...     

PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化

为成功表达猪繁殖与综合征病毒(PRRSV)结构蛋白GP5，通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF5扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5)。将d ORF5克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dORF5，表达产物以包涵体的形式存在，表达量为20．8％。Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白，为进一步研究PRRS病毒结构蛋白的结构和功能奠定了基础。     

结核分支杆菌Mtb8.4真核、原核表达质粒的构建与表达

低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切后分别克隆到真核表达载体pJW4303和原核表达载体pGEX-4T-1中,构成重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4,用限制性内切酶消化,PCR扩增及DNA序列分析等多种方法鉴定;并将正确构建的原核表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达。结果表明,重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4构建成功。构建的真核重组质粒pJW-Mtb8.4即可作为结核病DNA疫苗。原核表达载体pGEX-Mtb8.4在BL21(DE3)plysS中成功表达,将表达蛋白进行纯化,作为保护性结核分支杆菌抗原以便检测DNA疫苗的免疫效果。     

吉布森巴贝虫顶膜抗原-1基因的表达及表达产物的生物学活性

通过免疫筛选法，从构建的犬吉布森巴贝虫cDNA基因表达文库中筛选到1个cDNA克隆，此cDNA核苷酸全长2108bp，包含1个完整的开放阅读框，编码蛋白的分子质量约为62ku。经过分析，此蛋白（BgAMA-1）与其他巴贝虫属的顶膜抗原-1具有较高的同源性。为了研究其生物学活性，以此cDNA为模板，利用PCR扩增BgAMA-1的全基因，并将其克隆到pGEX-4T-3载体上，构建了原核表达载体pGEX-4T-3／BgAMA-1。通过Western—blotting对表达并纯化的重组蛋白的生物学活性进行分析。结果显示，构建的pGEX-4T-3／BgAMA-1能在大肠杆菌DH5口中表达，所获的重组抗原BgAMA-1在Western—blotting上仅与吉布森巴贝虫感染犬血清发生反应，证实其具有种特异性，在诊断方面可能有一定的应用价值。     

北京油鸡β-防御素-7基因原核表达质粒的构建及表达

为了研究β-防御素-7基因在大肠杆菌中的原核表达,试验以pGEM-T-GAL-7为模板,经PCR扩增GAL-7基因的编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化E.coliDH5α并在E.coliBL21(DE3)中诱导表达,并对目的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定。结果表明:重组质粒pGEX-4T-1-GAL-7经PCR及酶切测序鉴定,证明质粒构建正确;重组质粒经诱导表达后,可表达出分子质量约为33ku的GAL-7蛋白;表达产物以融合蛋白形式存在,在37℃条件下诱导4h表达量最高,最佳的诱导浓度为0.1mmol/L。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756)设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达。     

鸡PPARγ和C/EBPα的蛋白表达及其对肉鸡腹脂含量的影响

利用IPTG诱导含有原核表达质粒pGEX-4T-1/PPARγ和pGEX-4T-1/C/EBPα的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,表达GST-PPARγ和GST-C/EBPα融合蛋白,表达产物用Glutathione Sepharose 4B纯化,将纯化后的重组蛋白免疫肉仔鸡,检测其产生抗体情况及其对肉鸡腹脂含量的影响。SDS-PAGE结果显示融合蛋白GST-PPARγ在大肠杆菌胞内主要以包涵体的形式表达,分子量大约80ku;融合蛋白GST-C/EBPα在大肠杆菌胞内主要以可溶性蛋白形式表达,分子量大约62ku。主动免疫肉鸡结果表明PPARγ、C/EBPα及混合组鸡只均产生了较高水平的抗体,且PPARγ组肉鸡腹脂含量显著低于对照组。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。