农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

根癌农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化条件的研究

以马铃薯茎段作为受体转化材料.通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,对影响马铃薯遗传转化的多种因素(抗生素质量浓度、农杆菌质量浓度、共培养时间等)进行研究.结果表明,卡那霉素(kanamycin,Kan)梯度在抗性愈伤组织诱导、芽分化过程中以100 mg·L-1为宜,但在生根过程中以50 mg·L-1为宜,菌液质量浓度以OD600为0.5,共培养时间为3 d,抑菌剂的选择以羧苄霉素(carbenicillin,cb)更适合.对转基因植株进行PCR检测表明,目的基因已整合到马铃薯基因组中.     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

灵宝大枣无菌外植体的建立及茎段不定芽的诱导

为建立灵宝大枣的快速繁殖体系,以灵宝大枣枣头一次枝上萌发的嫩枝为外植体,对外植体的消毒、茎尖的生长和茎段不定芽的诱导进行了研究。结果表明:灵宝大枣外植体采用乙醇和升汞结合的常规消毒方法较好,污染率较低;适宜茎尖生长的培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+AC0.3%+蔗糖3%+琼脂粉7.0g·L-1,培养基MS+TDZ0.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1和MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+AC0.3%适宜枣茎段不定芽诱导,活性炭可以明显减轻褐变,TDZ诱导茎段不定芽的能力明显高于6-BA。     

柱花草茎段组织培养研究

以‘热研2号’柱花草茎段为外植体,研究不同激素种类及组合对试管苗诱导、增殖和生根的影响。结果表明:将带芽茎段接种在MS+6-BA 5.0 mg/L+GA30.5 mg/L的培养基中腋芽诱导率最高可达90%;最佳不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,其分化率达100%;最佳生根培养基为MS+IBA 1.0 mg/L+IAA1.0 mg/L。综上所述,该研究结果改变了丛生芽的产生途径,缩短了分化时间,提高了增殖速度,是快速繁殖柱花草苗的有效方法。     

富贵竹茎段保鲜研究

[目的]更好地解决富贵竹采后出现的黄化、软腐等问题。[方法]以株龄13个月的富贵竹为材料,采用不同的保鲜剂配方配制保鲜液,筛选出适合富贵竹茎段保鲜及贮运的保鲜液。[结果]用保鲜液200 mg/L Al2(SO4)3+100 mg/L Vc+200 mg/L CaCl2+1%Sug+250mg/L 8-HQC+0.02%CCC+1/1 000 70%甲基托布津冬季处理的富贵竹茎段上端切口状态最佳,收口细密,颜色均匀无黄化。200 mg/LAl2(SO4)3+0.05 mg/L 2,4-D+10 mg/L VB5+10 mg/L VB保鲜液在富贵竹茎段鲜重、叶绿素含量、CAT活性方面与其他配方保鲜液存在极显著差异(P<0.01),保鲜效果最好,防治下端切口(脚部)黄化的效果最佳。[结论]该研究筛选出的2个保鲜液配方能很好地解决富贵竹茎段上端切口开裂、失水皱缩和黄化问题以及茎段脚部黄化、植株腐烂、死亡等问题。     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

翠冠梨茎段组织培养的研究

以翠冠梨茎段为外植体进行组织培养研究，筛选出了较为适合该品种离体繁殖的基本培养基为1／2Ms，并通过无芽茎段培养获得了愈伤组织．通过有芽茎段培养获得了无菌苗．     

牛大力茎段组织培养技术研究

[目的]为牛大力的规模化生产提供依据,保护牛大力野生资源。[方法]以牛大力的幼嫩茎段作为外植体,研究其组织培养和离体快繁技术。[结果]用0.1%升汞处理外植体20 min,可获得无菌材料。以MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.1 mg/L为启动培养基,诱导率可达100%,接种后20 d,腋芽开始萌发,且生长正常。以MS+6-BA2.0 mg/L+IBA0.1 mg/L为增殖培养基,培养30 d后,增殖系数达7.0,有少量的愈伤组织产生,但不定芽生长发育正常。用1/2MS+IBA0.5 mg/L+IAA0.5 mg/L培养基进行生根培养,生根效果最好,生根率达80%,根生长状态良好。将生根的小苗移栽到椰糠∶砂为3∶1的基质中,覆盖地膜保湿15 d,成活率达85%以上。[结论]牛大力茎段组织培养的最佳生根培养基为:1/2 MS+IBA0.5 mg/L+IAA0.5 mg/L。     

黄连木茎段组织培养中防褐化技术研究

在取材部位、培养条件、培养方式以及在培养基中添加抗氧化剂等方面,对防止黄连木茎段褐化进行了研究。结果表明:半木质化的枝条为适合的外植体;培养初期以液体培养基较好;添加1.4 g/L抗坏血酸(Vc)的抗褐化效果最佳,其次为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和硝酸银(AgNO3),而硫代硫酸钠(Na2S2O3)和活性炭(AC)没有达到预期的效果。对外植体进行适当时间的低温和黑暗处理可减轻褐变。     

Extraction and Characterization of Antioxidant Compositions From Fermented Fruit Juice of Morinda citrifolia （Noni）

Extraction and characterization of antioxidative compositions from the extracts of fermented Xisha Noni (Morinda citrifolia L.) juice were studied. The antioxidative constituents of 184.6 g freeze-dried extracts of naturally fermented Xisha Noni juice were isolated successfully by petroleum ether, EtOAc and n-BuOH solvents, and the antioxidative effects were measured according to scavenging activity against hydroxyl generated in Fenton reaction system and superoxide anion radicals in pyrogallol autoxidation system. The EtOAc extract exhibited most significantly higher (P < 0.01) antioxidative activity than mannitol or vitamin C, while the petroleum ether and n-BuOH extracts showed lower activities compared to mannitol. Three antioxidant phenolic compounds, isoscopoletin, aesculetin and 3, 3′, 4′, 5, 7-pentahydroxyflavone (quercetin) were isolated from the EtOAc extract by several chromatography techniques for the first time. The results suggest that several compounds, in particular, the phenolic compounds, contribute separately or synergistically to the antioxidative activity of fermented Noni fruit juice.     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae中ProL蛋白的表达纯化及性质分析

【目的】从巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae中克隆proL基因,异源表达ProL蛋白并研究其理化性质,为解析ProL在合成Cytorhizins类新骨架活性化合物途径中的生物学功能奠定基础。【方法】利用PCR技术从C. rhizophorae中克隆proL基因,通过同源重组的方法将proL基因片段插入到pET28a原核表达载体,在大肠埃希菌Escherichia coli中异源表达,使用尿素对ProL蛋白梯度复性,采用SDS-PAGE技术和质谱测序对ProL蛋白进行分析和鉴定,运用生物信息学方法对ProL蛋白的氨基酸序列相似性进行分析,推测其编码蛋白的结构和功能。【结果】克隆得到proL基因的编码序列,开放阅读框全长909 bp,编码303个氨基酸,ProL蛋白分子式为C1495H2320N424O444S13,相对分子质量为33 754.22,原子数为4 696,等电点为5.69,为酸性蛋白。ProL蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式大量表达,尿素梯度复性获得了纯度为98.9%的ProL蛋白。生物信息学分析发现ProL氨基酸序列在已知蛋白中与Aspergillus ibericus XP025570169.1的酰胺水解酶2相似性最高,为59.40%,其三维结构模型中包含8个α-螺旋和8个β-折叠,保守氨基酸序列为207～216位。【结论】ProL蛋白属于酰胺水解酶超家族,预测其为一种新颖蛋白,该蛋白可能在生成高度氧化的二苯甲酮类化合物途径中起水解作用。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

海巴戟果提取物对凡纳滨对虾副溶血性弧菌的抑制效应

采用传统煎煮法提取海巴戟果有效成分,以副溶血性弧菌为试验菌株,将抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)及抑菌率作为检测指标,探讨海巴戟果热水提取物对水产动物致病菌的体外抑菌效果.结果 表明,海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的生长有抑制作用,其最小抑菌质量浓度(MIC)为25.00 g·L-1,最小杀菌质...     

胡椒木叶片离体培养与植株再生

探讨了胡椒木(Zanthoxylum piperitum)叶片的离体培养.选取胡椒木幼嫩叶片作为外植体,接种在不同激素组合的培养基上进行诱导培养,结果表明,最适的诱导培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.7 mg/L,分化率为91.7%,最适的增殖继代培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.7 mg/L,所产生的不定芽在1/2MS+ NAA0.4 mg/L的培养基上可全部生根,长成完整植株.首次证明以胡椒木的叶片为外植体可以进行快速离体培养.     

土壤养分、种植年限和种植方式对巴戟天寡糖含量的影响

目的 分析土壤养分、种植年限、种植方式(林下和非林下)等3个重要因子对巴戟天Morinda officinalis品质核心指标寡糖含量的影响,为我国“四大南药”之一的巴戟天种植提供理论与数据支撑。方法 在广东省德庆县巴戟天道地产区选择18个非林下种植点,采用随机多点采样法采集土样和不同生长年限巴戟天样品,测定土壤养分和巴戟天肉质根寡糖含量,分析土壤养分含量和不同生长年限与巴戟天寡糖含量的关系;分别采集林下和非林下种植的巴戟天样品,通过主成分分析探究林下和非林下种植方式巴戟天的品质差异。结果 土壤pH与巴戟天蔗糖含量呈极显著的负相关关系(P<0.01),与寡糖含量呈显著正相关关系(P<0.05);土壤全磷、速效磷、速效钾与1-蔗果三糖、耐斯糖含量呈显著正相关关系(P<0.05)。3年生巴戟天的蔗糖含量显著高于其他生长年限的巴戟天,4年生巴戟天的1-蔗果三糖含量显著高于2年生巴戟天。林下种植巴戟天的品质优于非林下种植。结论 提高土壤中速效磷与速效钾含量可以提高巴戟天品质,4年生巴戟天的药材品质最佳,林下种植有利于提高巴戟天品质。     

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。