猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建

为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA(shRNA)文库。此文库中的shRNA以pLKO.1为载体质粒,与pMD2.G和psPAX2包装质粒共同转染HEK293T/17细胞,获得慢病毒;利用慢病毒感染Marc-145,通过puromycin筛选获得稳定抑制猴源rab基因表达的细胞株。通过荧光定量PCR方法检测各细胞株中rab基因的敲减效率。本试验构建的文库包含187个克隆、涉及62种rab基因。荧光定量PCR结果证明,筛选出的稳定细胞株中相应rab基因mRNA的表达量均有显著下降。结果显示本试验成功构建了猴源rab基因shRNA文库并筛选出了稳定细胞株,可用于后续进一步研究Rab蛋白在PRRSV生活周期中发挥的重要功能。     

旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库的构建及其步筛选

利用差减杂交（减法杂交，subtractive hybridization)技术，以旋毛虫新生幼虫（newborn larvae,NBL)的cDNA作为试验方（tester)，以肌幼虫＋成虫的cDNA作为驱动方（driver)，制备新生幼虫差减cDNA,利用T载体构建NBL差减cDNA文库，获克隆株90个，以试验方的差减cDNA第2次PCR产物＋未差减cDNA为试验方探针，以驱动方的差减cDNA第2次PCR产物＋未差减cDNA为驱动方探针，在NBL差减cDNA文库中初筛NBL的期特异性克隆，获初筛克隆24个。这些初筛斯异性克隆进一步用Southern blot确认鉴定，获直阳性期特异性克隆2个（NBL SSC1，NBL SSC2）.DNASIS以及Blaster的分析结果显示，这2个克隆为旋毛虫的2个新基因，其中NBL SSC1编码糖蛋白，NBL SSC2编码丝氨本蛋白酶，本试验为旋毛虫期特异性基困全长序列的调取，分析，鉴定以及强保护性抗原基因的筛选奠定了基础。     

MDCK过表达SV40-LT基因稳定细胞系的构建

细胞永生化使细胞能够在保持遗传性状的同时无限增殖,细胞的体外永生化需要将HPV的E6和E7基因、SV40的LT基因或人端粒酶逆转录酶(hTERT)等导入目标内,而SV40-LT是建立永生化细胞最便捷的基因.本试验利用慢病毒感染方式将SV40-LT导入MDCK细胞中,阳性筛选后经qPCR和免疫荧光实验均检测到SV40-L...     

猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建

为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR)。首先构建含有T7-5'UTR-N~(pro)-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pc DNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系。酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pc DNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系。本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础。     

口蹄疫病毒VP2基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD...     

稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建

为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。     

成人肝cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍／盐酸胍法从人肝组织中提取ＲＮＡ，通过Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维柱分离出ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板，含ＮｏｔⅠ接头的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，在逆转录酶ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔⅡＲＴ催化下合成单链ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ），再在Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ聚合酶Ⅰ与ＲＮａｓｅＨ和ＤＮＡＬｉｇａｓｅ共同作用下，ｓｃＤＮＡ拷贝成双链ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）。经放射自显影测定，合成有全长ｃＤＮＡ片段。平末端ｄｓｃＤＮＡ与ＳａｌⅠ接头连接，ＮｏｔⅠ酶切后，通过过柱取掉小于５００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，大片段ｃＤＮＡ与载体ｐＳＰＯＲＴ１连接，转化受体菌ＤＨ５α，经稀释测定出含有重组子的文库大小为３．３×１０６。该文库适合于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

稳定转染pGM-CSF基因的哺乳动物细胞系的建立

构建稳定表达猪pGM-CSF基因的细胞系可以为工业化生产猪pGM-CSF并将其应用于新型兽药的开发提供生产细胞源。本试验用脂质体介导法将真核表达载体plRES2-EGFP-pGM-CSF瞬时转染BHK-21细胞,通过不同浓度的G418加压筛选和进一步采用单个克隆法筛选,建立稳定转染且高效表达pGM-CSF的BHK-21细胞株9个,采用Elisa方法测定稳定转染pGM-CSF的BHK-21细胞株细胞培养上清液中pGM-CSF的表达水平达到329.37±13.76ng/mL。为下一步从细胞培养物中大量提取目的蛋白并最终开发出一种用于提高动物疫苗免疫效力的新型生物制剂奠定基础。     

弓形虫ATG6基因敲除虫株的构建及其生长特性鉴定

酵母ATG6蛋白是磷脂酰基醇-3激酶(PI3K)复合物Ⅰ的组成成分,在自噬起始阶段促进自噬小体的形成。为研究弓形虫ATG6同源蛋白(Tg ATG6)生物学功能,本研究首先构建进化树对Tg ATG6基因进行同源性分析,并通过构建稳定表达红色荧光的(ATG6-m Cherry)虫株,以检测Tg ATG6的亚细胞定位情况。通过CRISPR/Cas9技术制备Tg ATG6基因缺失虫株,采用流式细胞术对该虫株的生长特性进行检测。实验结果显示,Tg ATG6基因在进化关系上与植物来源的ATG6同源关系较近。Tg ATG6在虫体内呈弥散分布,经16 h饥饿诱导后,该蛋白在弓形虫体内发生聚集。经序列分析显示,成功获得了两种Tg ATG6基因缺失虫株(ΔTg ATG6-1和ΔTg ATG6-2)。在ΔTg ATG6-2虫株中,Tg ATG6基因开放阅读框的593~612位点之间插入了226 bp外源序列,而在ΔTg ATG6-2中,不能够有效扩增靶序列,表明两种突变虫株的Tg ATG6基因均被有效插入失活。此外,该基因的缺失可能影响了虫株侵入宿主细胞的能力。Tg ATG6基因缺失株的成功制备为进一步研究Tg ATG6蛋白功能奠定了基础。     

猪成纤维细胞敲减卵泡抑素基因后的生物信息学分析

在哺乳动物中,卵泡抑素（follistatin,FST）不仅参与生殖调控,还与肌肉生长、脂肪沉积等显著相关。为了探究该基因在成纤维细胞中的生物学功能,本研究利用二代测序技术对敲减FST基因的猪成纤维细胞进行转录组测序,筛选差异表达基因,并利用在线生物学软件对差异基因进行GO功能注释及生物学通路富集分析。结果发现,敲减FST基因后共有370个基因显著上调,287个基因显著下调。与细胞增殖、凋亡相关的HOXA6、PARP14、ZBP1、NDUFB9、RAB13、FAM83D、THBS1和BTF3基因以及与疾病相关的ZNF354C、RNF213、IFIT1、CCL5和VPS13C基因均发生了显著变化。这些差异基因共得到51个GO功能注释,生物过程分类下的生物调节、细胞过程、代谢过程、单一生物过程和细胞组分分类下的细胞器、细胞区域、细胞及分子功能分类下的黏合条目下聚集的差异基因数量最多,均>200个。共发现12条显著富集的通路,包括3条与细胞增殖相关的通路（p53信号通路、细胞周期和真核生物中核糖体的生物发生）,4条与疾病相关的通路（阿尔茨海默氏病、沙门氏菌感染、亨廷顿病和非小细胞肺癌）,2条与肌肉收缩相关的通路（血管平滑肌收缩和心肌收缩）以及泛素介导的蛋白水解作用、肌动蛋白细胞骨架的调节和缝隙连接通路。以上研究结果表明,在成纤维细胞中敲减FST基因后,与细胞增殖分化和部分疾病相关的基因和生物学通路被显著富集,暗示FST基因在成纤维细胞的创伤修复过程中发挥重要的作用。     

猪蛔虫雄虫cDNA文库的构建

采用Tripure Isolation Reagent抽提猪蛔虫雄虫成虫的总RNA,用poly(A)PuristTM纯化试剂盒分离mR-NA。分离mRNA后,用Clontech公司的CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了猪蛔虫雄虫成虫的cDNA文库。结果获得了7.26×105独立克隆,重组率达96.7%,插入片段的平均长度约为1 kb。猪蛔虫雄虫cDNA文库的成功构建为利用文库筛选雄虫差异表达基因提供了材料来源,为研究猪蛔虫性别发育的分子机制奠定了基础。     

家蚕单性生殖早期胚胎SSH文库的构建及其序列分析

为了探讨家蚕早期胚胎性别决定的分子机制,以非减数分裂孤雌生殖(AMP)和双精雄核发育(BSA)技术获得的家蚕单一性别早期(2~24 h)发育蚕卵为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了正向和反向抑制消减杂交cDNA文库。在正向与反向抑制消减杂交文库中分别随机选择62个和46个克隆测序,分别获得43种和29种cDNA序列,其中25个为新的cDNA序列。生物信息学分析显示,抑制消减杂交文库中与单性生殖有关的高温、低温、辐射等诱导表达基因出现的频次较高。对部分文库序列进行半定量RT-PCR分析表明,这些基因在两种单性生殖早期发育胚胎中存在差异表达。     

家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证

研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。     

MDR1基因shRNA真核表达质粒的构建

为了构建靶向MDR1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达重组质粒,试验针对MDR1基因序列选取3个干涉靶点,设计合成3条编码shRNA的DNA模板,分别定向克隆到真核表达质粒pSilencer 3.1-H1中构建重组质粒,再进行菌落PCR扩增和测序鉴定。结果表明:菌落PCR扩增得到与预期大小相同的阳性带,经DNA测序证实插入片段完全符合设计要求,序列无突变。说明成功构建了3个靶向MDR1基因的真核表达重组质粒pSilencer 3.1-H1 shRNA。     

牛HSL基因shRNA干扰载体的构建及筛选

HSL基因所编码的激素敏感性脂酶对脂质代谢具有重要的调控作用,不仅能催化水解脂肪组织中的甘油三酯,还能水解不同组织的胆固醇酯,在机体能量供应和类固醇生成中发挥重要作用。为进一步研究HSL基因功能,本试验设计并构建4个HSL基因shRNA干扰载体,并将干扰载体转染到牛胎儿成纤维细胞中以及和设计构建过表达载体共转染到293T细胞中,转染48 h后,分别检测细胞内牛HSL基因的mRNA和蛋白质表达水平,筛选出具有较高干扰效率的shRNA表达载体。结果表明,在牛胎儿成纤维细胞中,4个shRNA载体在转染48 h后,shRNA-731组细胞中HSL基因的mRNA表达量显著低于shRNA NC对照组(P0.05),且干扰效率最佳;同时,在shRNA载体与过表达载体共转染293T细胞中,HSL基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于shRNA NC对照组(P0.05)。本研究为进一步探讨HSL基因功能提供了有效工具,也为研究其与牛脂肪代谢相关关系奠定了理论基础。     

美洲貂BAC文库的构建及毛皮产业重要候选基因的筛选

BAC文库是基因组分析的有力工具,再结合最新兴起且快速的深度测序技术,从而提供了一个很好的基因组计划的信息平台。本研究介绍了一个产于丹麦的雄性美洲貂CHORI-231BAC文库的构建方法及其特点,该文库包含了165888个克隆,平均插入片段在170kb,代表了约10倍的覆盖度。用一个有18432个克隆位点的高密度过滤器复制两份,用于杂交测序及公共使用。基于Overgo探针的表达序列标记,代表21个与毛皮工业关系密切的特征候选基因,用于BAC文库的筛选,这些候选基因包括了毛色、毛发生长、毛发长度和粗细及一些毛皮病毒疾病的感受器受体等。大规模测序以寻找其中19个相关基因。将获得的与这些基因相关的35个克隆进行高通量测序,并对大的重叠群进行组装。知道这些候选基因的全长序列之后有助于确认表型的位置及揭示目的性状的成因。另外,对1577个克隆进行了末端测序,获得了2505个克隆的末端序列(80%的BAC克隆),对剩余2Mb进行了分析,从而获得了貂皮整个基因组的快照。所构建的CHORI-321美洲貂BAC文库可用于基因和基因组兴趣位点的鉴定。试验描述了如何利用此文库进行特殊位点的鉴定,开发遗传标记,用于BAC末端测序和深度测序以选取克隆。这是首次利用454测序来挑选哺乳动物的克隆,确认了利用此技术获得小基因组目的基因序列信息的可行性。文中所获得的BAC末端测序结果已保存到GenBank数据库(HN339419-HN341884,HN604664-HN604702),从所选取克隆中获得的454序列重叠群的参考编码为(GenBank:JF288166-JF288183&JF310744)。     

弓形虫Rop46基因敲除虫株的构建及其生长复制能力评价

棒状体蛋白(Rops)是弓形虫的一类与侵入、复制相关的重要分泌蛋白。Rop46蛋白在弓形虫急性感染阶段和慢性感染阶段的表达存在显著差异。为探究Rop46的生物学功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了Rop46基因敲除重组质粒,制备了Rop46基因缺失虫株。序列分析表明,基因缺失虫株中的Rop46基因的编码序列缺失了82个碱基,证明本研究构建的基因敲除重组质粒能够有效的在弓形虫PLK虫株中敲除目的基因。利用流式细胞术对Rop46基因缺失虫株的生长特性进行检测和分析,结果显示Rop46基因缺失虫株的侵入和复制效率显著降低,表明缺失Rop46基因可能对PLK虫株的侵入及复制能力具有显著影响。     

稳定表达犬瘟热病毒基质蛋白的细胞系Vero-SLAM-M的构建

为了建立稳定表达犬瘟热病毒基质蛋白(M)的细胞系,从犬瘟热病毒狐狸源分离毒株SD16F中扩增出M基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo的Xho I/Not I位点处。重组质粒经PCR、Xho I/Not I双酶切及测序鉴定后转染Vero-SLAM细胞,利用G418抗性压力筛选阳性细胞,并采用RT-PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定转染细胞中M蛋白的表达情况。结果表明,成功构建了重组质粒pCI-neo-M,瞬时及稳定转染Vero-SLAM细胞后,RT-PCR和IFA能够检测到M基因的转录和表达,且G418筛选后细胞与其亲本Vero-SLAM细胞生长特性基本一致,表明获得1株能稳定表达M蛋白的细胞系,命名为Vero-SLAM-M。