猪速激肽3基因启动子活性及其表达调控的初步研究

为了确定猪速激肽3基因(tachykinin3,TAC3)核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5'端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA(siRNA)转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示:成功构建了TAC3基因5'端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高(P0.05)、mRNA表达水平显著上调(P0.01);干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调(P0.01);干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低(P0.05)。结果表明:转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

猪乳糖酶基因启动子及增强子的活性研究

采用PCR、TA克隆、构建pGL3.0 Basic荧光素酶报告基因载体并转染Caco-2细胞、Dual-Glo萤光素酶检测系统检测细胞系中荧光信号值的方法分析猪乳糖酶基因不同基因型的启动子与增强子活性。结果表明:GA型启动子和CG型启动子相比差异极显著(P=0.001),CG型启动子能显著促进猪LCT基因表达,而GA型启动子不能促进基因表达。A型增强子,可以使GA型启动子活性显著增强(P<0.05),使CG型启动子活性显著降低(P<0.01);G型增强子对GA型启动子或CG型启动子,均起显著的抑制作用(P<0.01)。猪LCT增强子和启动子多态性位点组合形成的单倍型促进基因表达的作用从高到低顺序为:A型增强子+GA型启动子>A/G型增强子+CG型启动子>G型增强子+GA型启动子。     

山羊卵巢维持基因FOXL2启动子活性及调控区域分析

旨在研究山羊卵巢维持基因FOXL2启动子活性以及探究该基因的调控机理。从NCBI数据库调取FOXL2基因启动子序列,用生物信息学软件对其核心启动子和转录因子进行预测分析。使用PCR技术克隆FOXL2基因启动子序列,并构建一系列缺失载体,瞬时转染293T和A375细胞,利用双荧光素酶基因检测仪测定相对荧光素酶活性值。结果表明,该基因启动子区域存在两个典型的CpG岛,分别位于(-920/+51(972bp))和(+125/+555(430bp))区域;经KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,重组载体质粒构建正确;在细胞中插入不同长度的FOXL2基因启动子片段,随着启动子5′端截短,荧光素酶转录活性先升高再逐渐降低。(-934/+324)区域存在转录活性,(-32/+324)区段包含了转录的基本元件;(-934/-456)区域在转录过程中对FOXL2基因起负调控作用,(-456/-192)区域为正调控区域。     

猪DKK1基因启动子区的克隆及其活性分析

旨在初步探索DKK1基因转录调控机制,本研究利用启动子在线预测软件分析了该基因启动子区序列特征,根据Ensembl数据库已公布的猪DKK1基因的5′侧翼区序列,设计特异性PCR引物进行扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,DKK1基因启动子中含有1个TATA-box、多种转录因子和1个CpG岛;DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,其中p-1 679/+292bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01)。-953~-1 679bp为核心启动子区域,-586~-953bp区域可能存在负调控元件,在-953~-1 679bp区域可能存在正调控元件。本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。     

绵羊CYP19基因卵巢启动子的克隆及其表达活性研究

本研究旨在克隆绵羊CYP19基因卵巢启动子序列片段,构建真核表达载体,并在细胞水平检测其组织特异性表达情况。参考已知序列设计特异性引物,PCR扩增绵羊CYP19基因卵巢启动子1.1和0.5kb两个片段,并与已公布的序列进行同源性比较;将测序正确的两个片段分别定向克隆到去除CMV的pEGFP-N2载体骨架中,构建真核表达载体pCYP19-1.1-EGFP-N2和pCYP19-0.5-EGFP-N2,重组质粒在脂质体LipofectamineTMLTX+PLUS介导下,分别转染绵羊的颗粒细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后24、48和72h观察EGFP表达情况。结果表明,扩增获得片段与已公布序列高度同源;应用转录因子结合位点预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TATA-box核心启动顺式元件,并含有多个潜在转录因子的结合位点。转染24h后,发现pCYP19-1.1-EGFP-N2在颗粒细胞可观测到绿色荧光表达,48h荧光细胞数量有所增加;转染72h时荧光细胞数最多;在胎儿成纤维细胞也有少量EGFP基因表达。pCYP19-0.5-EGFP-N2在颗粒细胞和成纤维细胞中均未检测到荧光。结果表明,扩增所得的绵羊CYP19基因卵巢启动子1.1kb片段可引导外源基因在颗粒细胞中的表达,可用于与繁殖相关的基因功能及转基因动物研究,但并非卵巢特异性启动子。     

鸡Dazl基因启动子活性检测及其诱导剂的初步筛选

论文旨在确定Dazl基因核心启动子活性调控区,并比较不同诱导剂的诱导效率,筛选出最佳基因诱导剂。用PCR技术扩增不同长度的Dazl基因启动子,插入到pEGFP-N1和/或pGL3-basic载体中,构建重组载体;再将这些重组载体分别转染DF-1细胞系和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Dazl基因启动子核心活性区域;添加单因素或多因素诱导因子,比较不同诱导剂以及诱导剂组合对鸡Dazl基因启动子活性的影响大小。如皋黄鸡Dazl基因的-932bp~-186bp区域在DF-1和GC-1两种细胞中,都有不同程度的启动活性,而-186bp~-39bp启动子活性几乎完全丧失;诱导剂筛选结果表明,FSH+E2组和Am80组、E2组能够显著提高Dazl基因启动子的活性,RA组、ATRA组、FSH组和睾酮组都不同程度地提高了启动子的活性,而睾丸提取液和BMP4对启动子活性没有显著影响。通过体外诱导实验筛选出如皋黄鸡Dazl基因最适诱导剂,为鸡ESCs体外向雄性生殖细胞分化的细胞诱导剂进一步筛选奠定了基础。     

影响猪肉质性状的基因及其表达调控

猪肉质主要受遗传、营养和饲养、屠宰加工条件等多种因素的影响。但从本质上讲,猪肉质性状主要由基因控制。本文系统综述了影响肉质性状的基因以及营养对这些基因表达的调控。为从分子水平深入开展肉质的研究提供参考。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(oRF2),经Bam H Ⅰ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性.结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性.本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础.     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

绵羊Oct4基因启动子的表达活性分析

Oct4(POU5f1)是诱导重编程的关键性因子,为检测克隆获得的绵羊Oct4基因启动子的表达活性,本研究将前期工作中克隆获得的绵羊Oct4基因启动子与携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的p Ac GFP1-N1载体相连接,构建由Oct4启动子驱动的真核表达载体(SPOct4-p Ac GFP1-N1),并采用脂质体转染法,分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎,以检测其表达活性。结果表明:Oct4启动子序列含有Sp1结合位点和CAAT框等功能区;转染后,小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎中检测到绿色荧光,并且在转染72 h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中未能观察到GFP的表达。说明由克隆获得的Oct4基因启动子驱动的真核表达载体具有在多能干细胞中特异的表达活性。     

猪PDZD8基因表达水平检测及其启动子区生物信息学分析

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是严重影响养猪产业的一种疾病,每年给世界各国带来巨大的经济损失。本研究旨在分析猪PDZD8在PRRS防控中可能发挥的作用。笔者以感染PRRSV不同时间点的Marc-145细胞为材料,检测猪PDZD8在PRRSV感染前后表达水平,利用生物信息学软件进行不同物种PDZD8基因启动子序列相似性分析及系统进化树的构建,分析猪PDZD8核心启动子区、CpG岛结构、转录因子结合位点等。RT-qPCR结果表明,随着PRRSV感染时间的增加,PDZD8的表达水平呈显著下降趋势。通过不同物种比对分析,猪PDZD8启动子区序列与人、印度狐狸、狗和蓝鲸的相似性较高,分别达到74.0%、75.1%、79.8%和81.0%,系统进化树也佐证了这一结果。生物信息学结构预测发现,猪PDZD8启动子区存在2～3个核心启动子区、2个CpG岛及多个转录因子结合位点。值得注意的是,科学家发现其核心启动子区和CpG岛存在重叠的现象,也发现了一些与PRRSV相关的重要转录因子结合位点。本研究为深入研究猪PDZD8在PRRSV感染过程中的作用提供了理论基础。     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制.本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系.进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF...     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

猪JMJD3基因真核表达及其对炎性因子表达调控的研究

为鉴定猪的JMJD3对炎性因子的表达调控作用,本研究对猪JMJD3基因进行了真核表达以及对过表达猪JMJD3的猪髋动脉内皮细胞(porcine iliac artery endothelial cell,PIEC)中的炎性因子进行了检测。结果显示:成功构建了Flag-JMJD3真核表达载体;通过Western blot分析,抗Flag抗体可以识别真核表达的Flag-JMJD3融合蛋白;通过间接免疫荧光分析,猪JMJD3主要定位于细胞核;与转染Flag-vector的PIEC相比,过表达猪JMJD3可以显著促进炎性因子(如IL-18和IL-12p35)的表达,说明猪JMJD3可以介导炎性因子的表达调控。该结果为进一步研究猪JMJD3调控炎性因子表达的机制奠定了基础。     

猪CFL2基因启动子区CpG岛的甲基化研究

运用生物信息学方法对猪CFL2基因启动子区Cp G岛进行预测,并采用甲基化特异性PCR(MSP)和重亚硫酸盐测序(BSP)分析猪CFL2基因启动子区Cp G岛的甲基化状态。生物信息学研究发现,猪CFL2基因启动子区存在Cp G岛,并且在启动子区的995~2 045 bp区域的GC分布密集。通过BSP法证明了长白猪CFL2基因启动子区Cp G岛出现甲基化,MSP法出现部分甲基化,提示只有1条链被甲基化,为猪CFL2基因在肌肉组织中的表达可能受甲基化调节提供了理论基础。     

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。     

猪白细胞介素-2的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。