猪囊尾蚴和华支睾吸虫液相基因芯片检测方法的建立

为建立一种可以同时检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的液相基因芯片方法,本研究以猪囊尾蚴ITS基因和华支睾吸虫ITS基因为靶序列,设计并合成特异性探针和引物,通过PCR方法扩增目的片段,构建阳性重组质粒标准品并对其进行测序,建立一种基于双重PCR的液相基因芯片检测方法。结果显示,扩增目的片段长度分别约为150 bp和170 bp,测序结果与Gen Bank登录的猪囊尾蚴和华支睾吸虫相关基因一致性分别为99.35%和98.27%;液相基因芯片对单重PCR产物和双重PCR产物的检测结果一致,特异性和重复性良好。应用该方法检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的灵敏度分别为5.13×104拷贝/μL和2.03×104拷贝/μL,比琼脂糖凝胶电泳灵敏高约8倍;应用该方法检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的变异系数均在8%以内,模拟污染样品的检验试验准确率达98%。本研究初步建立了可以同时高效、灵敏和特异检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的液相基因芯片方法,为人畜共患寄生虫的检测和监控提供了新方法。     

动物源性食品中弓形虫Nested PCR-RFLP分子检测技术的建立

目的为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分序列,找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段,设计套式PCR两对引物,以UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为模板,初步建立了检测两种虫体的Nested PCR技术。将纯化的Nested PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中,经鉴定、测序并进行同源性分析。结果Nested-PCR的外、内引物对两种虫体rDNA基因均能进行扩增,长度分别在800~900 bp、400~500 bp之间。内引物扩增DNA序列与公布的同种虫体DNA序列同源性较高,弓形虫和新孢子虫分别达99.1%、97.2%,但它们两者之间差异较大,同源性仅为86.6%。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切位点,挑选内切酶进行RFLP实验,结果表明新孢子虫NestedPCR扩增片段能被Vsp1酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和敏感性试验,实验证明该Nested PCR能对弓形虫和新孢子虫rDNA基因进行特异性的扩增,而对其它原虫基因未能扩增出任何片段;该Nested-PCR能检测出100个弓形虫速殖子/g猪肉。结论本实验建立Nested PCR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫,而且能明确区分弓形虫和新孢子虫。     

双重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌粘附素clfa A和Fnbp A基因

利用设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌进行PCR扩增,将目的基因回收并连接到T载体,鉴定后进行测序验证,然后对本实验室所分离鉴定的临床分离株进行双重PCR检测。结果显示,PCR产物经过电泳成像显示,仅有金黄色葡萄球菌分别在293bp和642bp处出现特异性条带。通过对金黄色葡萄球菌临床分离株双重PCR检测发现,其中95%以上存在粘附素基因clfa A和Fnbp A。证明本试验建立的双重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素基因的方法具有良好的特异性和可靠性。     

弓形虫半巢式PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序.结果表明,该体系能够扩增出约250 bp的片段,P1和P3能扩增出约500 bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504 bp片段与P30基因(X14080)的序列同源性为99.8%.该PCR检测体系特异性强,在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上未扩增出条带;敏感性高,最低检测为18 fg.该检测体系的成功构建为猪弓形虫的检测和流行病学调查提供了有力的技术支持.     

Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测I群禽腺病毒的液相基因芯片方法。根据Hexon基因序列设计特异引物,上游引物5'端加TAG序列,下游引物5'端加生物素,进行PCR扩增,将扩增产物与链霉素亲和蛋白、磁珠37℃孵育30 min,通过Luminex200仪器分析。用所建立的液相基因芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及病料样品的检测。结果该方法的特异性强;检测的敏感性可达1×102copies/μL;批内批间的变异系数都在5%以下;检测结果与SYBR Green I荧光PCR方法 100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特异性好、灵敏高、重复性好,可用于I群禽腺病毒的检测。     

牛新孢子虫病和弓形虫病双重PCR检测方法的建立与应用

为了建立区分检测牛新孢子虫病和弓形虫病的双重PCR方法,本研究以已发表的牛新孢子虫Nc-5基因和弓形虫GRA6基因分别作为目的基因,各设计一对引物,可分别扩增出222bp和124bp的目的条带。经优化反应条件,建立了可同时检测牛新孢子虫病和弓形虫病的双重PCR方法。该方法对上述两种基因的检测灵敏度均为103copies/反应,只比单PCR的灵敏度低10倍,且具有较好的特异性和重复性。经临床应用验证,该方法可用来对新孢子虫病和弓形虫病进行同步快速检测。     

弓形虫529 bp基因的克隆及序列分析

本研究对安徽猪源弓形虫529 bp重复序列进行了分析,为其分子流行病学研究以及诊断方法的建立奠定基础。首先对病料虫体基因组DNA进行提取,然后对弓形虫529 bp基因进行PCR扩增、克隆、测序并对测序结果进行比对、同源性分析和构建系统进化树。结果显示,PCR扩增产物约为528 bp,与已报道的弓形虫同一基因序列具有高度同源性,与GenBank报道的EF648169.1株同源性最高,达99.5%,且遗传距离最为接近;与其他5株猪源弓形虫比对显示主要突变区域在第31～74位和第100～141位碱基。表明该猪源弓形虫与犬源弓形虫EF648169.1株为姊妹株;本基因序列碱基突变较少,保守性较好,适合作为弓形虫病诊断的靶基因。     

梨形虫和伊氏锥虫双重PCR检测方法的建立

为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法，试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物，以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化，对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明：本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带，而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性，梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法，能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。     

犬弓形虫巢式PCR检测方法的建立及初步应用

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫的基因扩增无条带;灵敏度试验结果显示,该方法最低可以检出0.134 pg的弓形虫基因,比目前国标PCR方法高100倍。对感染弓形虫犬的组织样品检测发现,巢式PCR能在感染犬的不同组织中检测出弓形虫基因。建立的犬弓形虫巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为该病的检测奠定了基础。     

基于tlh和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法

为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。