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利用双生病毒简并引物PA/PB,对山东寿光地区保护地疑似感染番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的番茄植株进行PCR检测,结果证明番茄病叶由TYLCV侵染所致。以提取的病叶总DNA为模板,扩增得到长约770 bp的TYLCV-CP基因片段,克隆至pEASY-T1 Simple载体,然后用Xho I和EcoR I将其切下并插入到pET-32a表达载体中,构建了寿光地区TYLCV分离物的外壳蛋白基因原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导获得了50 kD重组蛋白,Ni2+-NTA亲和层析纯化和Western印迹分析证明目的蛋白为TYLCV外壳蛋白,且具有良好的抗原活性。 相似文献
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以陕西杨凌番茄生产基地感病(TYLCV 症状)番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl(GenBank 序列号:KC293824,未公布);克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明:获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒(TYLCV-Yl)分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79~97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组:TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
(TYLCV-Yl)属于TYLCV 亚组Ⅰ。 相似文献
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以感TYLCV番茄品种“合作909大红番茄”和抗TYLCV番茄品种“华美204”为试材,采用荧光定量PCR技术,研究了TYLCV对感病、抗病番茄植株根、茎、叶片中水杨酸、茉莉酸和乙烯3条防御信号途径中关键因子的表达量的影响,以期了解番茄抗TYLCV的机制.结果 表明:接种后30 d,感TYLCV材料“合作909大红番茄”各器官的TYLCV含量均显著高于抗TYLCV番茄材料“华美204”,且根部含量最高,茎部次之,叶片含量最少.水杨酸途径相关基因PR1、NDR1、T(A2.1在叶片中“合作909大红番茄”的相对表达量显著低于“华美204”,但在茎部和根部中高于“华美204”.NDR1和TGA2.1在根部的相对表达量最高,茎部次之,叶片最低.茉莉酸途径相关基因LoxD、Pin2在叶片和茎中“合作909大红番茄”的相对表达量低于“华美204”,但在根部高于“华美204”,LoxD、Pin2在根部的相对表达量最高.乙烯途径相关基因ERF3、EIN2在叶片中“合作909大红番茄”的相对表达量低于“华美204”,但在茎部和根部中高于“华美204”,ERF3和EIN2在根部的相对表达量最高,茎部次之,叶片最低.说明水杨酸、茉莉酸、乙烯3条信号传导途径共同参与了番茄抗TYLCV的过程. 相似文献
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小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因植物表达载体的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)是危害中国葫芦科作物主要病毒之一。试验以该病毒中国分离物外壳蛋白基因的克隆载体pZCP-87(含ZYMV的CP基因)为材料,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,从胶上回收目的基因,与经过同两种酶酶切的植物表达载体pBIN438连接,转化感受态的大肠杆菌细胞,提取质粒,经PCR和SalⅠ/BamHⅠ双酶切验证,已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上(重组质粒命名为pBZCP5),采用冻融法完成了对pBZCP5质粒的农杆菌转化。该工作是通过转基因获得抗ZYMV病毒研究的基础。 相似文献
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小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因导入西瓜的遗传转化 总被引:1,自引:0,他引:1
研究了西瓜品种ZKM的再生体系和农杆菌介导小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)的外壳蛋白(cp)基因导入西瓜的遗传转化体系。结果表明,质量分数0.6%琼脂是适宜种子萌发的基本培养基,切取5d龄的西瓜无菌苗子叶为外植体,接种在MS+BA2.0mg/L诱导培养基上,诱导不定芽效率最高。选用75mg/L卡那霉素筛选西瓜抗性芽较为合适,外植体经预培养2~3d,菌液浓度以OD600nm值为0.4,共侵染10min有利于提高西瓜转化的效率。经PCR检测,ZYMVcp基因已经导入西瓜植株,转化频率为0.15%。 相似文献
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通过PPT质量浓度的梯度试验,筛选出番茄子叶出愈、芽分化和再生植株生根的最适宜PPT浓度均为1.0 mg/L.pCPGO和pCBGO两个植物表达载体转化8个番茄自交系材料的试验结果表明,不同番茄自交系对这两种表达栽体的遗传转化效率存在较大的差异;相同的载体转化不同的番茄自交系,其遗传转化率也存在较大的差异;同一番茄品系,由于转化载体不同,遗传转化率也不同.pCPGO和pCBGO转化率最高的分别为Pr5 76.47%和Pr1 72.4%;而低的分别仅为Pr3 13.89%和Pr4 2.7%. 相似文献
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探索乙肝病毒表面抗原/截短型HCV核心蛋白融合基因在植物中表达乙肝丙肝双价抗原的可能性.以期为进一步研制植物乙肝丙肝双价口服疫苗打下基础。利用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在丙肝病毒(HCV)截短型核心蛋白序列的5′端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成-融合基因BC,测序结果正确。将融合基因BC克降到植物表达载体pBin438上,获得pBin438BC,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,采用叶盘法转化番茄。获得了15株抗卡那霉素的番茄植株。对抗性植株进行PCR及Southern检测,8株获得阳性信号,表明目的基因已整合到了番茄基因组中。提取阳性植株的总蛋白.经透析后.将适当浓度蛋白质点在PVDF膜上,用Dot-ELISA方法验证番茄中表达蛋白的活性。结果表明,转基因番茄中有重组蛋白的表达。 相似文献
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探索乙肝病毒表面抗原/截短型HCV核心蛋白融合基因在植物中表达乙肝丙肝双价抗原的可能性,以期为进一步研制植物乙肝丙肝双价口服疫苗打下基础.利用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在丙肝病毒(HCV)截短型核心蛋白序列的5'端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成融合基因BC,测序结果正确.将融合基因BC克隆到植物表达栽体pBin438上,获得pBin438BC,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,采用叶盘法转化番茄.获得了15株抗卡那霉素的番茄植株.对抗性植株进行PCR及Southern检测,8株获得阳性信号,表明目的基因已整合到了番茄基因组中.提取阳性植株的总蛋白,经透析后,将适当浓度蛋白质点在PVDF膜上,用Dot-ELISA方法验证番茄中表达蛋白的活性.结果表明,转基因番茄中有重组蛋白的表达. 相似文献
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采用番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)侵染克隆接种技术和实时荧光定量PCR方法,从TYLCV在番茄叶片内复制繁殖的角度,系统研究了不同环境温度下单个和多个抗性基因叠加对病毒复制的影响,以期为合理进行抗病基因整合,选育抗TYLCV的番茄新品种提供理论指导。结果显示,(1)春季温室栽培环境下,含Ty-1/ Ty-3的番茄材料能抑制病毒复制,接种后28 d其体内病毒含量仅是感病材料病毒含量的千分之一;秋季温室栽培环境下,这种抑制作用降低,病毒含量与感病材料相当。精确控温种植的含Ty-1/Ty-3的近等基因系番茄材料中病毒的含量变化趋势与此相同。(2)含Ty-2的番茄材料在春秋两季栽培环境下,均表现出对病毒复制的抑制作用,接种后28 d其体内病毒含量仅为感病材料病毒含量的万分之一。(3)同时含有2个基因(Ty-1和Ty-2)和多个基因(Ty-1、Ty-2和Ty-3)的番茄材料在抑制病毒复制方面不存在累加效应。 相似文献
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为了开发番茄对番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)抗病性鉴定的新技术,设计了在番茄试管苗中接种TYLCV的试验。将对TYLCV感病的品种‘Moneymaker’、‘中蔬6号’、‘丽春’和抗病品系‘AVRDC CLN 2123 A’在试管中进行组织培养,21 ~ 25 d后切取长2.0 ~ 2.5 cm的嫩枝,将嫩枝基部在含TYLCV-[CN:SH2]侵染性克隆质粒的农杆菌EHA 105菌株的悬浮液(OD600 0.5)中浸润1 min接种。14 d后,感病品种试管苗开始出现TYLCV症状并且愈来愈重,28 d后TYLCV症状十分典型,56d后症状极其严重:叶片窄小、黄化、极度卷曲,植株严重矮化,停止生长或死亡;而同样接种的抗病品系试管苗却无一发病。接种的番茄试管苗经PCR检测显示,从感病品种试管苗中均能扩增到356 bp的特异片段,而在抗病品系中无此条带。这些结果显示了在试管里鉴定番茄品种或材料对TYLCV抗性的可能性。 相似文献
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以伏令夏橙叶片中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到一条约600bp、含钙离子结合蛋白基因(CsCaBP)的片段,将此片段克隆到pMD-19T中,经测序分析该片段与甜橙基因组中的对应序列完全吻合。设计2对带有限制性内切酶位点的特异性引物,以cDNA为模板扩增到2个CsCaBP片段,并连接到TA克隆载体pMD-19T上;经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pFGC5941的查耳酮合成酶(CHSA)内含子两侧,构建成功CsCaBP的RNA干扰载体,但未获得转基因植株。将CsCaBP的正向片段定向克隆到具有CaMV35S启动子的pF-GC5941表达质粒上,构建成功CsCaBP过量表达载体。将构建好的表达载体导入根癌农杆菌LBA4404菌株,转化酸橙下胚轴,经PCR检测,获得9株过量表达转基因植株,荧光定量PCR验证发现目的基因在转基因植株中有不同程度的表达。 相似文献
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以黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因为目的基因,以大肠杆菌DH5α为表达载体体外操作寄主菌,农杆菌LBA4404为最终双元载体寄主菌。将RT-PCR获得的目的基因片段连接到pMD18-Tsi mple Vectoer上,冻融法转化到大肠杆菌扩繁后,经限制性核酸内切酶酶切插入表达载体适宜酶切位点上,重组质粒DNA经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中得到工程菌,完成含目的基因的双元载体构建,为培育抗CMV病毒的番茄品种打下基础。 相似文献
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采集杨凌五泉、揉谷和李台3个番茄主产区表现矮化、黄化及曲叶症状的植株嫩叶,克隆番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)基因全长并测序,依次得到病毒分离物TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3和TYLCV-SXYL4。通过多序列比对、系统发育树构建及蛋白质结构和理化性质预测等生物信息学方法进行基因组和蛋白质的特征分析,结果表明,杨凌区3个TYLCV分离物之间全长核苷酸相似度为99.3%~99.4%,是不伴随卫星分子的单组分病毒,属TYLCV-IS株系的不同分离物,全长为2 781 nt;与山东寿光病毒分离物TYLCV-SDSG亲缘关系最近,相似度为99.6%,与陕西泾阳的分离物TYLCV-SX8相似度为99.1%,与以色列株系TYLCV-IS相似度达97.7%~97.8%;编码6个蛋白质,其中CP、Rep、REn为跨膜蛋白,V2、TrAP、C4为胞内蛋白,Rep和REn为稳定蛋白,CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。 相似文献