西瓜NBS类同源序列的克隆与分析(摘要)

R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分,在目前已经发现的植物抗病基因中,NBSLRR类占了绝大多数,在植物抗病基因中占有重要地位。NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分,含有8个保守基序,包括P-loop(又称Kinase-1a)、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。对西瓜NBS的克隆和分析将有助于筛选西瓜抗病基因及各种抗病基因的分子标记,而且通过对西瓜NBS的结构、表达和调控的研究,将有助于深入阐释西瓜的抗病机制。以根结线虫抗病西瓜材料‘红籽瓜’和感病西瓜材料‘ZDPI0006’为试材,根据西瓜NBS保守区设计简并引物及特异引物50对,根据葫芦科抗病基因序列在西瓜基因组数据库搜索同源序列,并以此设计特异引物1对,分别提取西瓜叶片g DNA和RNA并反转录成c DNA,采用PCR扩增西瓜抗病基因同源序列,琼脂糖电泳检测回收目标条带,克隆测序后结果提交到Gene Bank进行序列比对,提交至Pfam在线分析蛋白质功能,利用Clustalx与其他物种的抗病基因进行同源性分析,利用dnasp等软件进行序列多态性分析。结果表明,49对引物中共有43对引物在抗、感材料中成功扩增到目的片段,其中有4对引物在抗感材料中扩增出差异片段,简并引物W856在抗、感材料间扩增到一条约750bp的差异片段,测序结果提交至NCBI比对显示其与预测的黄瓜抗TMV的N端类似蛋白存在88%的同源性,根据葫芦科抗病基因在西瓜基因组数据库搜索同源序列设计的特异引物W6580在抗、感材料间扩增出大小一致的约800bp的片段,测序结果提交至NCBI比对,结果显示其与预测的黄瓜抗线虫类似蛋白存在90%的同源性,dnasp软件分析显示抗、感材料之间存在4个单核苷酸多态性位点。     

甘蓝型油菜紫色酸性磷酸酶基因类似物的生物信息学分析

利用生物信息网络数据库,对甘蓝型油菜紫色酸性磷酸酶基因(PAP)类似物编码的蛋白进行生物信息学分析,以预测该蛋白的理化性质、分子结构与生物学功能。结果表明:该基因编码的蛋白含481个氨基酸,其蛋白的分子式为C2520H3714N666O719S19,分子量为55.45kDa,等电点为6.35,为亲水性分泌型蛋白,并且不稳定;存在3个跨膜螺旋区域及3个卷曲螺旋结构,含有1个信号肽、39个潜在磷酸化位点和3个N-糖基化修饰,存在6种类型特定的功能位点,主要定位于高尔基体;氨基酸序列同源性分析表明,该基因编码的蛋白与甘蓝型油菜PAP12家族具有较近的亲缘关系,直系同源于甘蓝型油菜PAP12-5;二级结构主要为无规则卷曲、延伸链和α?螺旋,具有较为明显的10个螺旋和26个折叠;具有PAP的保守结构域,属于金属磷酸二酯酶超家族成员;根据保守结构域及功能位点分析发现该基因属于紫色酸性磷酸酶类,可能属于甘蓝型油菜PAP基因家族成员,预测其编码产物在植物磷高效利用与吸收中发挥重要的生理功能。生物信息学分析及结合蛋白的结构与功能预测分析可为深入研究甘蓝型油菜PAP提供理论指导。     

RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展

RGA克隆法是利用抗病基因产物的保守结构域人工设计简并引物,以植物gDNA或cDNA为模板进行PCR扩增而克隆植物抗病基因同源序列的方法。随着各种植物基因组测序计划的完成及计算机和生物信息学的发展,植物抗病基因的克隆取得了很大进展,目前人们已经从植物中克隆得到100多个抗病基因。研究表明,大多数抗病基因都存在NBS-LRR、STK、LZ、TIR等功能保守的结构域,其中大部分都为NBS-LRR类型,利用NBS-LRR保守结构域设计PCR引物已经从植物中扩增出大量的RGA。简要综述了已克隆NBS-LRR类抗病基因的结构特点和功能、RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展,并探讨其未来的发展与应用。     

黄瓜抗病基因类似序列( RGA) 的同源性分析和Southern鉴定

 使用ClustalW和DNAMAN 3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N 基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性, 并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明: 15个黄瓜RGA中, 核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsRGA4和CsRGA5, 其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9, CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性; 其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46% , 最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物, 用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在, 其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针, 与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交, 证实了各个RGA在基因组上的存在, 同时发现, CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝, 其余为双拷贝。     

果树R基因同源序列克隆的初步研究

用2对根据已知植物抗病基因(R基因)编码的蛋白质的NBS保守区而设计的特异简并引物,对荔枝、龙眼、芦柑、柚子及银杏的基因组DNA进行体外扩增.其中一对引物(P1/P2)在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中获得的扩增产物均表现为一条大小约500bp的明亮谱带,而银杏扩增产物的亮带则在约750bp处,且弥散在400 ～ 1000bp之间.另一对引物在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中没有特异扩增带,而在银杏中获得了一条400 ～ 600bp的较亮的宽带.将荔枝、龙眼、芦柑和柚子的500bp特异扩增带以及银杏的400 ～ 600bp条带回收克隆,并分别筛选几类阳性克隆进行测序.共获得15个片段的序列.经比较发现,来自荔枝、龙眼、芦柑和柚子的12个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列的一致性为15.5% ～ 47.1%;而3个来自银杏的片段均不是RGA,其中1个与反转录酶有较高的同源性,另2个在GeneBank中没有找到同源序列.该结果显示,应用同源扩增技术克隆果树RGA是可行的,但银杏作为古老的裸子植物,其抗病基因的结构与现代物种可能有很大差异.     

黄瓜NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析

 简要报道利用简并引物从黄瓜基因组DNA中分离得到15条NBS类型RGA, 登录GenBank获得登录编号分别为AY5554822AY555495和AY545993。其中10条为可通读序列, 与已报道的甜瓜RGA有较高的同源性。     

番茄ERFb.2转录因子的克隆、生物信息学及表达特征分析

通过克隆番茄SlERFb.2基因,并运用生物信息学对该基因的编码产物进行一级、二级、三级结构分析,并通过qRT-PCR技术检测SlERFb.2基因在不同处理不同时期的表达量,以期为番茄对非生物胁迫的响应机制提供参考依据.结果 表明:SlERFb.2基因含有开放阅读框5个,共编码258个氨基酸,属于酸性蛋白;其二级结构以α-螺旋为主,预测蛋白定位于细胞核上;且含有39个磷酸化位点与15个糖基化位点;启动子区主要以I-box为主,且含有多个诱导基因表达的顺势作用元件;三级结构相对简单,且该转录因子在番茄中存在4个互作蛋白,系统发育树得番茄与马铃薯的亲缘关系最近;qRT-PCR显示该基因对低温的响应特别敏感.     

苹果NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析

 NBS-LRR 蛋白是植物细胞内普遍存在的主要抗性蛋白家族,该家族的蛋白包含有NBS 结构域和LRR 结构基序,在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。从‘嘎啦’苹果中鉴定了一个NBS-LRR 类基因,命名为MdNBS-LRR1,（GenBank 登录号：JX126858）。该基因全长为3 116 bp,包含一个2 826 bp 的开放读码框,编码包含941 个氨基酸残基的蛋白质;其氨基酸序列含有典型的NBS-LRR类抗病基因所具有的NB-ARC 结构域。Blast 分析发现MdNBS-LRR1 与大豆NBS-LRR 类抗性蛋白具有较高的氨基酸序列一致性（60%）。RT-PCR 分析结果表明,MdNBS-LRR1 在‘嘎啦’苹果的幼叶、茎、功能叶、芽、皮和花等组织中均有表达,在幼叶中的表达量最高,茎中最低。苹果轮纹病病原菌侵染可促进MdNBS-LRR1 基因表达上调,接种后24 d 表达量最高,是对照的10.6 倍左右,另外,在‘嘎啦’苹果幼苗叶片中,SA、MeJA 和ACC 均可诱导该基因的表达,表明MdNBS-LRR1 基因的表达受到与抗病相关信号转导途径的调控。     

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

正目的:利用同源序列法分离核桃的NBS(Nucleoti de binding site)类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。方法:以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与     

草菇α-淀粉酶基因的生物信息学分析

基于草菇(Volvariella volvacea)基因组和转录组数据,通过生物信息学的方法对草菇α-淀粉酶基因进行基本理化性质、内含子和外显子结构、信号肽、亚细胞定位和功能位点的预测与分析,并构建系统发育树。结果表明:编码草菇α-淀粉酶的基因有5个,分别为GME2151、GME6695、GME9075、GME10698和GME10705;5个基因编码的蛋白相对分子量介于38.8~64.6kD之间,磷酸化以Ser位点为主,大都存在信号肽,亚细胞定位在细胞外,保守结构域和空间结构相似度较高。和其它的担子菌一样,草菇α-淀粉酶可以分为两类:GME9075和GME10698归为α-淀粉酶Ⅰ类,GME2151、GME6695和GME10705属于α-淀粉酶Ⅱ类。     

黄瓜bZIP基因家族鉴定及功能分析

为研究bZIP家族基因在黄瓜表皮毛发育过程中的功能,利用生物信息学方法对黄瓜bZIP家族基因进行全基因组鉴定、染色体定位、系统进化分析、基序分析和结构域预测,并结合转录组分析和拟南芥异源转化,筛选与黄瓜表皮毛发育相关的基因。结果表明,黄瓜全基因组编码75个bZIP家族成员,不均等地分布在黄瓜的7条染色体上。该家族成员分为10个亚家族,各亚族成员具有相似的基因结构和保守基序。其中,对4个差异表达的bZIP基因CsaV3＿7G003290、CsaV3＿4G004890、CsaV3＿2G031960和CsaV3＿3G046530的拟南芥同源基因突变体表型观察发现,Atbzip47和Atbzip56拟南芥突变体茎秆处表皮毛数量显著减少。将CsaV3＿2G031960和CsaV3＿3G046530基因在Atbzip56突变体中进行异源转化,回补了Atbzip56突变体的表型。此结果为进一步解析CsbZIPs基因成员在黄瓜表皮毛发育中的功能和调控路径提供了参考。     

中华猕猴桃fasciclin基因家族生物信息学分析及克隆

【目的】探讨fasciclin基因在中华猕猴桃中的生物信息。【方法】对中华猕猴桃雌株38个fasciclin基因进行生物信息学分析和克隆其中一个与性别相关的fasciclin基因。【结果】38个fasciclin基因编码133～606个氨基酸。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点范围分别为10～56个、2～26个、0～8个。38个fasciclin基因拥有1～9个motif结构(取值10),其中Motif3为共同具有。68.42%fasciclin蛋白为不稳定疏水性蛋白。2 000 bp启动子区共预测到TFs 110个,较多的TFs依次为BBR-BPC、TALE和AP2,9个基因没有预测到TFs结合位点。UPGMA聚类法把38个fasciclin蛋白分成2类。基因克隆序列(723 bp)具有fasciclin保守结构域,该序列只比对到8号染色体上。【结论】fasciclin基因保守性不强;克隆序列与中华猕猴桃雌雄性状显著关联,但与美味猕猴桃雌雄无关联;雌株中的同源区没有注释到基因。     

管状花目中多酚氧化酶的序列分析与功能预测

以管状花目(Tubiflorae)中5个物种7个多酚氧化酶基因(PPO)序列为研究对象,采用序列对比分析和功能预测方法,研究了这些基因序列的碱基、酶蛋白氨基酸序列数量与比例,以及氨基酸序列中蛋白激酶C磷酸化、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化、N-糖基化、N-豆蔻酰化、酰胺化、cAMP及cGMP蛋白激酶磷酰化6个功能位点结构域特征,以期揭示PPO酶调控的功能位点。结果表明:管状花目中丹参毛状根PPO基因含有G+C碱基最多,氨基酸中丙氨酸和亮氨酸含量也最高(16.9%),并含有最多的酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点(11个)。丹参毛状根PPO酶不具备信号肽结构,有1个卷曲螺旋,是无跨膜结构的亲水性蛋白。该试验为研究PPO酶调控酚酸类物质次生代谢的分子机制,特别是蛋白与蛋白、蛋白与基因之间的互作奠定了基础。     

黄瓜CsaDMR6-2基因的克隆及特征分析

通过系统进化树和黄瓜霜霉病主效QTL分析,确定了与拟南芥抗霜霉病突变基因DMR6同源性较高的Csa DMR6-2基因为黄瓜霜霉病感病候选基因。以15份不同遗传背景的抗病和感病黄瓜自交系为材料克隆了Cs DMR6-2基因,经过与已知功能的拟南芥基因DMR6、DLO1和DLO2的氨基酸进行多序列比对、蛋白质二级和三级结构的预测,结果显示:欧洲温室型的抗病材料K15和K58的Csa DMR6-2的CDS序列在856bp处有1个碱基的突变,引起相应氨基酸由丝氨酸(TCA)变成丙氨酸(GCA),进而引起其部分蛋白质二级和三级结构的变化;Csa DMR6-2与拟南芥的DMR6、DLO1和DLO2基因具有很高的同源性,且同属于一类氧化酶,两者具有相同的结构域,而抗病材料的变异位点均发生在催化区。试验结果为进一步研究Csa DMR6-2的基因功能和利用感病基因获得霜霉病持久广谱抗性打下了良好的基础。     

园艺及园林观赏植物抗病基因类似物的研究进展

目前已从不同植物中分别克隆出70余个植物抗病基因.根据已克隆的抗病基因的结构特征,可分为4大类:NBS-LRR、STK、胞外LRR、STK与胞外LRR.对于园艺及园林观赏植物抗病基因同源序列(RGA)的研究已应用在基因克隆、分子标记、基因定位和基因进化中,但相关报道较少.RGA的分析,对于在果蔬生产及园林绿化上指导我们培育具有广谱性抗病的植物品种具有深远的意义.     

‘红阳’猕猴桃全基因组NBS-LRR类基因家族的生物信息学分析

【目的】分析‘红阳’猕猴桃(Kiwifruit)中含有核苷酸结合位点(Nucleotide binding site,NBS)类基因。【方法】利用Kiwifruit Genome Database、Pfam和Coils Server网站,和Bioedit、MEGA 5.0、Clustal W软件,分析确定‘红阳’猕猴桃的NBS-LRR基因类型、结构和系统发育学关系。【结果】在‘红阳’猕猴桃全基因组中共有96个NBS-LRR类基因,其中27条NBS-LRR类基因分布在基因簇内,可根据其结构进一步划分为20类基因。并对NBS-LRR类基因家族进行了氨基酸多序列比对和系统进化树分析,发现整个NBS-LRR基因家族可分为三个亚家族。【结论】相对其他物种,‘红阳’猕猴桃NBS-LRR类基因总数少,缺少TIR结构,具有LRR结构的基因所占比重低,NBS结构不完整,这些特点可能与其感病性有关联。     

杏NBS基因家族鉴定及其对果实抗病性的影响

[目的]探讨杏果实发育过程中NBS基因家族的表达规律,为果实抗病机制研究提供理论指导.[方法]运用生物信息学方法进行NBS基因家族鉴定与转录组分析.[结果]在串枝红杏基因组中共鉴定到155个NBS抗病基因,主要分为CNL型(126个)和NL型(29个),45％的基因主要分布在1号与2号染色体上,顺式作用元件较多且大多属...     

霜霉病菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库的构建及抗病相关基因筛选

以接种黄瓜霜霉病菌的抗病黄瓜品种‘649’的叶片为材料,使用改良SDS法提取总RNA,构建黄瓜叶片全长cDNA文库,得到的原始文库滴度为5.5 × 106 pfu • mL-1,扩增后的文库滴度达6.5 × 109 pfu • mL-1,重组率约为99%,插入片段在0.5 ~ 2.0 kb之间,大多在1.0 kb左右。随机选取3 360个克隆进行测序,共拼接出2 507个unigenes,其中包括211个重叠群（Contigs）和2 296个单拷贝EST（Singlets）。生物信息学分析显示：这些unigenes中存在427条与植物防御/抗病相关的基因,其中包括两类抗病基因和细胞程序性死亡相关基因,这些基因的发现为下一步研究黄瓜抗病机理,克隆抗霜霉病相关基因提供了重要的参考。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3，将其命名为CsCBF3，GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp，
编码204 个氨基酸。进化树分析表明，CsCBF3 隶属于CBF 基因家族，与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近，
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明，CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域，N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区，且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达，且
其表达量在迅速达到峰值后又降低，说明CsCBF3 是一个快速响应基因，推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。