编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的草菇冷诱导基因Cor3功能验证

将草菇(Volvariella volvacea)冷诱导基因Cor3cDNA序列经EcoR I酶切克隆到原核表达载体pPROK-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、分离纯化发现该蛋白的分子量约为43kD,等电聚焦电泳结果表明,该蛋白的等电点为6.1,HPLC检测说明合成方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟4.5μmol,DNTB与同型半胱氨酸颜色反应测定水解方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟0.7μmol,根据上述特性可以确定草菇冷诱导基因Cor3所编码的蛋白是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因上游序列的克隆和分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(sahh)全长序列设计两个嵌套引物,与Takara LA PCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR扩增,得到sahh上游调控序列,通过序列分析发现,该序列含有1个TATA盒和4个CAAT盒.应用MatInspector程序分析sahh上游调控序列,发现该区域存在1个耐盐因子,1个热激因子,2个DRE元件和2个ABA应答元件.     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。     

草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the cold-induced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

广叶绣球菌谷胱甘肽S-转移酶多样性及光照下URE2P gst的表达分析

利用生物信息学方法分析广叶绣球菌(Sparassis latifolia)基因组谷胱甘肽S-转移酶(glutathione Stransferases,GST)编码基因。结果表明:广叶绣球菌基因组可编码27个gst,均含有GST保守的N端或C端结构。27个GST分属于8个不同的家族,其中URE2P家族GST数量最多(8个),OMEGA家族含6个,GTE家族含4个,C1、GHR、SIGMA和GTT家族各含2个,EF1Bγ家族含1个。各家族间的GST具有相似的保守基序。利用实时荧光定量PCR技术分析了不同光照时长胁迫下6个URE2P家族GST基因的表达动态。结果表明有4个GST基因(MF327518,MF327511,MF327527,MF327514)在诱导48h后表达量最高,2个GST基因(MF327506,MF327510)在诱导96h后表达量最高。     

盐胁迫条件下杜梨叶片差异表达基因qRT-PCR内参基因筛选

为了准确评价盐胁迫下杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge.）目标基因表达量,筛选q RT-PCR适用内参基因。利用杜梨的全基因组注释信息和转录组测序数据,选择Actin2(Chr15.g01351)、EF1α-1(Chr3.g19898)、EF1α-2(Chr4.g38173)、EF2(Chr5.g06899)、GAPDH-1(Chr16.g30426)、GAPDH-2(Chr13.g23532)、TUBB(Chr5.g06472)、UBQ(Chr4.g40121)等8个候选基因,设计Actin2、EF1α-1、EF1α-2A、EF1α-2B、EF2、GAPDH-1、GAPDH-2、TUBB-A、TUBB-B、UBQE等10对qRT-PCR引物。首先对10对引物的扩增效率进行了测定,再以200 mmol·L-1的NaCl溶液对两个杜梨家系（盐城和连云港）幼苗进行0、24、48、72 h盐胁迫处理。提取叶片的总RNA,反转录合成cDNA,使用10对引物进行q RT-PCR扩增,根据扩增产物使用delta Ct、BestKeeper、geNorm和NormFinder等4...     

草菇gpi基因结构及其异核体表达协同增效作用

以草菇(Volvariella volvacea)单孢菌株PYd21(基因组测序菌株)和PYd15(基因组重测序菌株)为材料,配对获得可正常出菇的异核菌株H15-21.克隆测序了PYd21和PYd15的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(gpi),并对基因的结构和表达谱的表达量进行分析.结果表明,PYd21和PYd15的gpi基因序列相同;转录组reads定位、paired-end分析结果显示,gpi基因全长2404 bp,ORF全长1659 bp,编码552个氨基酸,含有8个外显子、7个内含子,5'UTR长度为101 bp、3'UTR为183 bp,RNA加工过程中有2种可变剪切类型、3个可变剪接位点;表达谱测序结果,PYd21、H15-21和PYdI5 gpi基因的表达量分别为84.53、1079.31和270.95TPM,草菇gpi基因表达表现出异核体表达协同增效作用,暗示着异核菌株中的2种不同来源的细胞核可能存在相互作用,这一结果在实时荧光定量PCR检测后得到证实.     

Construction of a Plasmid and a Standard Curve for Real-time Quantitative PCR of the Cold-induced Cor3 Gene from Volvariella volvacea

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the coldinduced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

草菇多糖单加氧酶基因Vv-lpmo 1的序列分析及其表达规律

依据草菇(Volvariella volvacea)基因组和转录组数据,采用ZOOM软件将转录组Reads定位到基因组的分析方法,从草菇中鉴定了一个多糖单加氧酶基因Vv-lpmo1,对其进行生物信息学分析,并对其高效诱导物进行筛选,采用定量PCR方法研究其在降解稻草时表达量的变化规律。结果表明:草菇Vv-lpmo1基因DNA序列长1432bp,有9个内含子,预测编码305个氨基酸的蛋白质;生物信息学分析表明该蛋白质有分泌信号肽,且含有两个完整的保守结构域:N端的glycoside hydrolase family 61(GH61)结构域和C端的cellulose-binding domain(CBD)结构域。通过对葡萄糖、无碳源(饥饿诱导)、微晶纤维素、滤纸、稻草和木屑6种不同基质诱导草菇菌丝的定量PCR,结果筛选出稻草对Vv-lpmo1基因有最强的诱导作用。进一步研究稻草诱导不同时间的变化过程中,该基因的表达规律为0~4h先下调;4~12h恢复到初始水平;12h以后开始迅速上调并维持较高水平。本研究表明草菇多糖单加氧酶基因Vv lpmo1属于诱导表达型基因,可能在草菇降解稻草基质中起着重要作用。     

草菇gpd基因的克隆、序列分析和其启动子的推测以及冷诱导对其表达方式的影响

草菇3-磷酸-甘油酯脱氢酶（GPD）基因全长1489bp,含有9个内含子。gpd全长cDNA含有1157核苷酸,包含1个编码337个氨基酸的1011 bp开放阅读框和1个95 bp 3’端非翻译区。在1220 bp的5’端侧翼区内检测到启动子元件,该元件含有2个TATA框和3个CAAT框,分别位于开始密码子ATG上游第80、559、333、340和406 bp位点。Southern杂交分析表明,草菇基因组含有1个拷贝的gpd基因。Northern杂交分析表明,gpd基因的表达不受冷胁迫诱导。     

低温对草菇菌株碳氮利用能力的影响

分别将供试草菇菌株在 - 18℃ (± 1℃ )和 4℃ (± 1℃ )下进行低温处理 ,并在 2 5℃下将经低温处理菌株对 6种碳源和 6种氮源的利用能力与对照比较。结果表明 ,不同草菇菌株对低温的耐受能力存在明显差异 ,低温使草菇菌丝复活时间延长、生长势减弱、生长速度减慢或丧失对部分氮源的利用能力。但邓庄V2 3 、DwV 1和白草菇等菌株经低温处理后 ,在部分培养基上的菌丝生长速度快于对照     

草菇丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因的克隆及序列分析

根据担子菌丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因编码的氨基酸序列设计两对简并引物,通过巢式简并PCR方法获得草菇(Volvariella volvacea)丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因(vv-stpk1)的保守片段,然后通过基因组步行的方法获得了vv-stpk1全长序列。vv-stpk1全长为2 003 bp,含有8个内含子,长度分别为72、57、53、54、45、50、55和48 bp,可编码522个氨基酸残基的多肽。推定的氨基酸序列与玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、木糖发酵酵母(Pichia stipitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)中与细胞形态发生相关的丝/苏氨酸蛋白激酶Orb6的相似性分别为81%、77%和76%,对VV-STPK1蛋白的系统发生学分析的结果表明,VV-STPK1与Orb6同源蛋白聚在同一进化枝上,这些数据都支持VV-STPK1蛋白为与细胞形态发生相关同源蛋白的推定。