乙醇脱氢酶I类基因全长cDNA的克隆与表达

I类乙醇脱氢酶（ADH）在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADHl，ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT—PCR同时克隆乙醇脱氢酶I类基因全长eDNA。测序后的eDNA被克隆在表达载体pTYBll上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADHl，ADH2和ADH3的酶活力分别为2．0±0．3，0．8±0．2，1．5±0．2U·mg^-1。     

大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆、表达和酶学活性分析

利用RT-PCR技术,从大豆叶片总RNA中扩增了乙醇酸氧化酶(GO)基因的cDNA序列,克隆到pMD19-T simple上,进行测序,然后将乙醇酸氧化酶的cDNA克隆至原核表达载体pRSET-A上,转化E.coli BL21,并对该基因在E.coli中的表达进行了研究。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。     

枸杞甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

根据GenBank中的植物甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出BADH基因的部分保守序列,并利用巢式PCR、5′-RACE和3′-RACE获得BADH基因的全长cDNA。测序结果表明:BADH全长为1 869 bp,包含1 512 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含503个氨基酸残基、分子质量为55.12 ku、等电点(PI)为5.19,包括醛脱氢酶高度保守序列VTLELGGKSP和其后287 bp处与酶功能有关的Cys的假定蛋白质。mRNA分析表明:BADH基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用。     

葡萄白藜芦醇合酶基因cDNA克隆及原核表达

从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的RS基因编码的氨基酸同源性达到97%以上,与其他属的RS基因编码的氨基酸同源性达到64%以上。生物信息学分析表明,该蛋白分子量为43kD,等电点pI=6.2,包含392个氨基酸残基。将RS的全长cDNA插入到表达载体pET28a中构建重组表达质粒pET28a-RS,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol.L-1IPTG诱导4h时该基因表达效果最好,诱导产物为1个约43kD的蛋白,为...     

板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。     

家蚕丙酮酸脱氢酶激酶基因的克隆与原核表达

丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)在糖代谢的调控中具有重要的作用,为了研究家蚕PDK(BmPDK)的功能,以蚁蚕总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增了BmPDK的cDNA,构建原核表达载体pET-28a-BmPDK进行表达和纯化。结果显示,克隆的BmPDK全长cDNA与NCBI公布的序列一致;Western bloting检测表明BmPDK蛋白得到了表达,且主要以包涵体形式存在;IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L、最佳诱导时间为8 h;2,6-二氯吲哚酚法间接测定结果表明,纯化的BmPDK蛋白具有酶活性。     

淇河鲫生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到淇河鲫(Carassius auratus gibelio var)的生长激素(GH)基因cDNA,其GenBank注册号为DQ350437.分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列,结果显示:克隆到的淇河鲫生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽.SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/LIPTG诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体.细菌裂解液沉淀溶于8mol/L尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量约为23.5kD的单一蛋白带.     

番茄植物络合素合酶基因全长cDNA的克隆及其表达特点

为从分子水平上揭示PCS基因在番茄重金属螯合解毒过程中的作用机制,该研究以番茄(Lycopersi-con esculentum Mill.)品种苏红2003幼苗cDNA为模板,根据NCBI上登录的其他植物的植物络合素合酶基因保守区设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆番茄植物络合素合酶基因cDNA全长,进一步利用半定量RT-PCR,探讨不同重金属处理后该基因在番茄不同器官中的表达情况。结果显示:番茄植物络合素合酶基因(LePCS1)的cDNA序列长度为1 878 bp,5′非编码区长113 bp,3′非编码区长256 bp。推导该基因编码503个氨基酸组成的蛋白,其相对分子质量为55 600,等电点6.66。NCBI蛋白质比对结果显示:LePCS1由2个典型的植物络合素亚家族结构域组成,并具有19个可与金属离子结合的半胱氨酸(Cys)残基位点,其中包括4个相邻的Cys-Cys元件(90~91位、350~351位、368~369位和416~417位氨基酸)和11个单一Cys残基(56位、109位、113位、138位、144位、231位、332位、393位、396位、424位和489位氨基酸)。进化...     

团头鲂主要组织相容性复合体Ⅰ类基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

为了解团头鲂MHCⅠ类基因的结构,采用cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术,首次成功克隆了团头鲂“浦江I号” F₀基础群体及选育F₈世代的MHCⅠ类基因,共获得3条cDNA全长序列。序列全长为2 040～2 079 bp,含有87~102 bp的5′-UTR,1 035～1 044 bp的编码区（包括信号肽,alpha 1、alpha 2和alpha 3三个结构域,跨膜区和胞质区）及911~946 bp的3′-UTR区,分别编码347、344个氨基酸。F₈世代序列的核苷酸/氨基酸的同源性很高,为89.0%/93.0%,而与F₀世代的同源性较低（75.3%~77.0 % 和71.1%~71.4%）,呈现出明显的分子多态性。分析表明,团头鲂具有经典的MHCⅠ类分子的空间结构,与人类HLA-A2的抗原肽结合区的晶体结构相比,二者的差异主要集中在5个(I~V)区上。在Neighbor-joining(NJ)法构建的分子进化树中,团头鲂与草鱼的亲缘关系最近,与鲑鳟鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类及人类的亲缘关系则渐远。RT-PCR组织表达分析表明,团头鲂MHCⅠ类基因在所检测的的8个组织中均表达,在鳃、头肾和血液中有较强的转录本,中等强度表达于肝脏和脾脏,在后肾、肠和肌肉中表达较弱。     

苎麻CCoAOMT基因全长cDNA克隆与序列分析

【目的】试图分离和克隆苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因。【方法】采用RACE技术克隆基因，对序列应用ClustaW 1.82软件进行在线分析，将苎麻mRNA序列、mRNA编码区序列以及氨基酸序列与已报道的其它植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树。【结果】获得了苎麻CCoAOMT cDNA全长序列(GenBank注册号：AY651026)；苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶是氧甲基转移酶类；苎麻CCoAOMT基因mRNA序列与已报道的其他植物的相应序列不能聚为一类，其差异明显大于其它植物间的差异。苎麻CCoAOMT基因mRNA编码区序列与玉米（Zea mays：ZMA242980、ZMA242981）的同源性高于其他植物。推导的苎麻CCoAOMT酶蛋白氨基酸序列与杨树（Populus balsamifera：AJ224894、AJ224896）、美洲山杨（Populus tremuloides：PTU27116）的同源性高于其他植物。【结论】苎麻CCoAOMT基因cDNA与其它植物的相应序列具有同源性。     

乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达

从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k 538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达栽体pET -30 a(+)上构建重组表达质粒pETlac 4.将pETlac 4电击转化到大肠杆菌BL 21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3 h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475 U/mL,37℃仅为0.134 U/mL.     

枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

为研究枸杞苯丙氨酸解氨酶基因LcPAL在干旱和盐逆境中的作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了LcPAL基因(Genbank No.KX781247)。该基因cDNA长度为2 544bp,含有2 163bp的完整开放阅读框,编码720个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树表明,枸杞LcPAL与茄科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测发现,LcPAL基因在枸杞的叶中表达量最高,果实中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,但表达模式不同。研究结果推测从枸杞中克隆获得苯丙氨酸解氨酶(LcPAL),是典型的PAL家族成员,在枸杞各组织发育过程中具有重要功能,且在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程也起一定作用。     

辣椒素生物合成途径基因pal克隆及原核表达分析

以辣椒品种"益都红"胎座RNA反转录的cDNA为模板,根据pal基因保守序列设计引物,PCR扩增得到1条全长2157bp的目的片段。该基因包含有完整的开放阅读框架,编码718个氨基酸,预测的分子质量为73ku。与多种植物PAL的氨基酸序列有一定的同源性,其中与同科同属植物朝天椒的同源性最高。应用分子克隆的方法成功地构建了pET-32a-pal重组表达质粒,优化得到诱导表达的最佳条件为:IPTG0.3mmol·L-1,温度28℃,时间6h,经SDS-PAGE检测6×His-PAL在E.coli中得到了高效表达,重组蛋白分子质量约为93ku。因此,该基因的克隆与原核表达为深入研究辣椒PAL的基因结构、生物活性、表达调控机制以及辣椒素的生物合成机制奠定了重要基础。     

人瘦素基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR从人的脂肪组织中克隆了人OB基因,并将其在原核生物E.coli BL21(DE3)中重组表达,采用SDS-PAGE法检测表达情况,鉴定表达产物。结果表明,人瘦素在大肠杆菌中表达量占总蛋白的20%左右,为瘦素的进一步研究奠定了基础。     

山药SuSy基因全长cDNA序列的结构、进化和表达

 【目的】阐明山药蔗糖合成酶（SuSy,EC 2.4.1.13）基因家族的成员及其功能。【方法】利用RT-PCR和RACE技术从大薯（Dioscorea alata ）地下块茎中分离到1个SuSy基因（DaSuSy1）全长cDNA序列,并用DANSTAR和Clastal W等软件分析该序列的结构特征和分子进化,采用RT-PCR和Northern杂交对该基因的时空表达进行分析。【结果】DaSuSy1全长cDNA序列大小为2 673 bp,其中最大开放阅读框（ORF）、5′端和3′端的非翻译区分别含有2 445 bp、7 bp和221 bp,而且3′端的非翻译区含1个24 nt的Poly（A+）尾;最大ORF可编码814个氨基酸,分子量为92.76 kD,等电点为6.42,含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及两个磷酸化位点,即N端的Ser10和C端的SNLDRRET781 RR(Ser774～Thr781)。该基因在全长cDNA序列、编码区cDNA序列及其编码氨基酸序列的水平上与GenBank中所选已知物种SuSy基因相应序列的同源性分别达45.3%～71.3%、45.8%～74.8%和50%～84.7%,与禾本科植物SuSy基因家族中一些成员亲缘关系最近。DaSuSy1在非光合器官中表达,其中地下块茎表达最为强烈,而且从块茎形成初前期开始表达一直增强至盛中期,此后逐渐减弱。【结论】DaSuSy1是山药SuSy基因家族成员,归为单子叶植物SuSy基因的组别,仅在非光合器官中表达编码负责蔗糖-淀粉转化功能的SuSy同工型。     

奶牛TNMD基因的克隆与原核表达

从奶牛组织中克隆Tenomodulin(TNMD)基因的cDNA序列,采用双酶切后连接表达载体pGEX-4T-1,转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达。结果表明,TNMD基因的序列全长为957 bp,通过双酶切构建的表达载体pGEX-TNMD在BL21大肠杆菌中成功表达了分子量为59.68 kDa的融合蛋白。     

菠菜硝酸还原酶基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR技术从低富集硝酸盐的菠菜品种中克隆得到硝酸还原酶(NR)基因,并进行了同源性分析;构建该基因的原核表达载体pET-NR,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,为深入研究并揭示菠菜的硝酸盐富集机制奠定了基础.结果表明:获得的NR基因包含完整的开放阅读框(2 781 bp),编码926个氨基酸,与菠菜、甜菜NR核苷酸序列的同源性分别为99％、80％,与其氨基酸序列的相同性分别为99％、86％.SDS-PAGE电泳显示重组菌经IPTG诱导表达出104 ku左右的蛋白质,与预期大小一致.