副结核分枝杆菌ISMav2基因的克隆与序列分析

以副结核分枝杆菌C-2染色体DNA为模板,以ISMav2基因特异性引物进行PCR扩增,获得约340 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出重组质粒pMDTM18-T-ISMav2,为进一步研究ISMav2基因及其在副结核病诊断中的应用奠定了基础.     

牛18ku-bFGF基因真核表达载体构建与鉴定

将牛18ku-bFGF基因全编码序列插入质粒pEGFP-N1中,构建真核表达载体pCMV-bFGF,并用菌落PCR、酶切和测序等方法对重组质粒进行了鉴定.研究结果表明,检测结果均一致于预期,表明牛18ku-bFGF基因全编码序列已正确插入到载体中.     

牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达

为构建牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,根据GenBank牛瑟氏泰勒虫p23表面蛋白基因序列（D84447）,分别设计2对特异性引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫基因组DNA,采用SOE—PCR技术构建双拷贝p23基因,克隆到pMD-18-T载体上,经过PCR、酶切鉴定及测序后,亚克隆到pVAX-Ⅰ真核表达载体上,经过鉴定后采用脂质体法将重组质粒pVAXI-2p23转染到BHK-21细胞,用IFA和RT—PCR来鉴定目的基因的表达情况．结果表明,成功构建了牛瑟氏泰勒虫双拷贝p23表面蛋白基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中获得表达．     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

牛白细胞介素-18基因原核表达载体的构建

根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

气肿疽NanA基因真核表达质粒的构建与鉴定

为构建气肿疽NanA基因真核表达质粒,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了1对特异性引物,以气肿疽梭菌基因组DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,将连接后的pMD 18-T-NanA进行鉴定分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达质粒连接。结果表明:构建的重组克隆质粒pMD 18-T-NanA和重组表达质粒pVAX1-NanA经PCR鉴定和酶切鉴定正确。该试验成功构建了气肿疽NanA基因真核表达质粒,为气肿疽核酸疫苗的制备奠定了基础。     

牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达

根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增.经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功.从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a( )质粒连接,构建pET32a( )-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60 ku.     

猪偶发分枝杆菌核酸修复蛋白基因的克隆与序列分析

以猪源偶发分枝杆菌菌株染色体DNA为模版,以recA基因设计引物进行PCR扩增,获得约1000bp的DNA片段,将扩增产物片段克隆至pGM-T载体中,通过蓝白班筛选、质粒PCR鉴定以及序列分析鉴定,成功构建pGM-T-recA重组质粒,为进一步研究偶发分枝杆菌katGI基因及其在偶发分枝杆菌疾病的检验、免疫和预防治疗提供了一定的基础。     

牛Cathelicidin BMAP-28基因的克隆及原核表达

根据GenBank中公布的牛BMAP-28基因mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从牛骨髓总RNA中扩增出BMAP-28基因片段,将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、酶切和测序分析鉴定,获得重组克隆载体pMD18-T-BMAP28.以重组质粒为模板,扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,转入原核表达载体PE...     

腐蹄病A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

以腐蹄病A型节瘤拟杆菌染色体DNA为模板,根据设计的上、下游引物进行PCR反应,扩增出了大小约0.78kb的基因片段,用T4DNA连接酶将PCR产物与pGEM-T-Easy载体连接,构建了重组质粒。并以EcoRV和SalI双酶切重组质粒鉴定目的基因的插入方向。经序列测定,克隆的目的基因片段为Pili基因。     

甜菜夜蛾核多角体病毒Se29基因的克隆与序列分析

[目的]克隆得到甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）ORF29全长基因（Se29）。[方法]用PCR的方法扩增Se29基因,将其克隆至pMD18-T载体上,获得了重组质粒T-Se29,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为642 bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列（Genbank accession No.NC002169）核苷酸同源性100%。序列分析结果表明,Se29基因编码蛋白（SE29）存在一个可能的跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,1个微体C末端靶信号位点。蛋白序列比对结果表明,SE29与棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovir-us,HaSNPV）ORF128（Ha128）的编码蛋白（HA128）具有较高的同源性,其在病毒侵染过程中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se29基因,为研究其在病毒侵染过程中的作用奠定了试验基础。     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

甜菜夜蛾核多角体病毒Se62基因的克隆与结构分析

[目的]克隆并分析甜菜夜蛾核多角体病毒（却odoptera exigua muhicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）ORF62全长基因（Se62）。[方法l采用PCR的方法扩增Se62基因,将其克隆至pMDl8．T载体上,获得了重组质粒T．5e62,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为1128bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列（No．NC_002169）核苷酸同源性100％。序列分析表明,Se62基因编码蛋白（SE62）存在明显的跨膜区域,有多个蛋白激酶c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N．糖基化位点。蛋白序列比对结果表明,SE62属于杆状病毒P48蛋白超级家族成员,与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa califorica muhicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）P48蛋白的同源性为52％,其在病毒复制中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se62基因,为研究其在病毒复制中的功能奠定了基础。     

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

木薯醇腈酶在枯草芽孢杆菌中的表达及活性检测

醇腈酶(α-hydroxynitrile lyase,HNL)能够催化羰基化合物和HCN立体选择性的加工形成手性醇腈化合物。以含有木薯醇腈酶基因的重组质粒pET28a-HNL为模板,应用PCR扩增得到HNL基因,将其连接到pMD18-T载体中进行测序分析,然后通过Nde I和Xba I2个酶切位点将其连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5Z2中,获得了含有HNL基因的重组质粒pMA5Z2-HNL,转化蛋白质三缺陷的枯草芽孢杆菌DB1342。SDS-PAGE显示HNL在枯草芽孢杆菌DB1342中获得表达,产物分泌到细胞外,每毫升发酵液中获得了2.108 U的醇腈酶。     

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及序列分析

构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (L isteria Monocytogenes,L MO)溶血素基因重组质粒。文章采用 PCR方法扩增出 L MO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin,hly)基因 ,将其克隆到 p MD18- T中 ,转化 E.coil TGI。经酶切及 PCR鉴定 ,而后进行测序。 hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6 bp。重组质粒经酶切及 PCR鉴定表明为正确重组子。核苷酸序列鉴定表明 ,其核苷酸序列与国外报道的 L MO F6 789株、L MO F2 36 5株同源性分别为 99.70 %和 99.39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99.82 %和 98.90 %。在国内首次克隆到 L MO hly全基因 ,为研究hly的功能和探讨 hly蛋白作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

牛瑟氏泰勒虫P23主要表面蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。