草莓叶片中5种新microRNA的RT-PCR鉴定及靶基因分析

micro RNA(miRNA)是来自真核生物自身基因组的非编码小分子RNA,在转录后水平上负调控基因表达,在植物的生长发育和胁迫应答等方面起重要作用。以栽培草莓艳丽为试材,利用RT-PCR技术克隆草莓叶片中5种新miRNA的前体及靶基因,分析靶基因的结构特征与功能,结果表明:草莓mi R-6,mi R-12,mi R-13,mi R-14,mi R-29的前体长度分别为513 bp,309 bp,464bp,334 bp和343 bp,均能形成典型的茎环结构,其中mi R-12、mi R-13的成熟miRNA序列在茎环3'端臂上,mi R-6、mi R-14、mi R-29成熟miRNA序列在茎环的5'端臂上。mi R-14与mi R-29的靶基因分别为854bp和690bp,与森林草莓基因组对应序列一致性为98.72%和99.42%,其中mi R-29靶基因是GRP基因,编码143个氨基酸,推测mi R-29靶基因在草莓植株的胁迫响应中有重要调控作用。本研究丰富了草莓miRNA的研究,为揭示草莓miRNA的生物学功能奠定基础。     

大豆中不同除草剂作用靶标酶的miRNA前体克隆

对前人已预测的大豆miRNA的4个茎环结构进行引物设计、克隆miRNA前体,先将设计好的接头与大豆小RNA的3'末端连接,然后利用与接头序列互补的引物对小RNA进行反转录,即可得到加接头的第1链cDNA,再用基因特异引物GSP和通用接头引物的组合,经PCR扩增后即可捕获位于已知序列区和接头之间的3'端RNA序列。结合3'端引物的测序结果,初步预测成熟miRNA可能的6个组合是同一家族。     

叶片保存方法对RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒的影响

【目的】探究通过RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒最好的叶片保存方法。【方法】经自然风干法、硅胶干燥法以及氧化钙干燥法保存后，采用RNA小量提取试剂盒法提取被病毒侵染草莓叶片总RNA,利用Thermo NanoDrop 2000测定核酸质量浓度和质量并使用RT-PCR方法对SMYEV进行检测。【结果】经氧化钙干燥保存后可提取高质量的RNA,30 d后仍可通过RT-PCR获得扩增产物。【结论】氧化钙干燥保存效果最好，操作简单，成本低，可广泛应用于大量草莓叶片样本的长距离运输，提高草莓病毒检测效率，为草莓无毒栽培提供保障。     

三种草莓病毒的多重RT-PCR检测方法

目前,草莓主要有3种病毒侵染,本研究通过改进CTAB法对经过茎尖剥离的组培四季草莓叶片提取总核酸,采用多重RT-PCR技术同时检测草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒和草莓镶脉病毒。电泳结果显示提取的总核酸中可见总DNA条带和完整的RNA条带,并采用两步法RT-PCR获得了目的条带。本研究建立了多重RT-PCR同时检测草莓病毒的技术体系。     

激素处理后绵羔羊和成年母羊卵巢颗粒细胞miRNA特征分析

【目的】通过small RNA高通量测序技术,筛选绵羔羊和成年母羊差异表达miRNA,进一步挖掘和鉴定与卵泡发育相关的相关基因,揭示其性状差异的信号通路及分子调控网络。【方法】以绵羔羊和成年母羊颗粒细胞为研究对象,应用高通量测序技术进行small RNA文库构建,获得miRNA表达谱,鉴定差异表达miRNA,进而对这些差异表达miRNA及其靶基因进行功能注释、聚类分析及通路富集等。【结果】从2个样本miRNA库鉴定出238个已知miRNAs和79个新miRNAs。共获得9个差异miRNA,与成年羊相比,羔羊有4个miRNA上调,5个下调。其中,oar-miR-106a上调倍数最大(1. 85),oar-miR-10a下调最为显著(-2. 20)。对差异miRNAs进行GO富集和KEGG通路富集分析表明,新陈代谢途径富集的基因最多。利用qRT-PCR对5个随机挑选的miRNA进行验证,结果与测序数据一致,说明测序结果可靠。【结论】miRNAs可能在激素处理后对绵羊生殖生理中起着重要的作用,包括卵泡和卵母细胞的发育,颗粒细胞的增殖等。     

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

烟草不同组织总RNA的提取方法初探

【研究目的】寻找烟草各个组织总RNA最佳的提取方法。【方法】以烟草K326的根、茎、叶、蕾、花和种子为材料,分别采用试剂盒法、Trizol法和CTAB法提取烟草6个组织总RNA进行对比。【结果】烟草不同组织总RNA提取方法有所不同,试剂盒法和Trizol法只能提取出根、茎、叶、蕾和花的总RNA,而不能提取种子总RNA;CTAB法能提取出6个组织的RNA。3种方法提取的RNA质量好,均能满足RT-PCR以及后续实验的要求。【结论】试剂盒法较Trizol法和CTAB法简单、快捷,适合于烟草除种子以外其余组织总RNA快速提取,CTAB法适合烟草所有组织总RNA提取。     

鸡白痢沙门氏菌感染对雏鸡脾脏miRNA表达谱的影响

【目的】鉴定感染鸡白痢沙门氏菌后雏鸡脾脏差异表达的miRNA，为阐明miRNA在鸡白痢沙门氏菌感染中的调控机制提供理论基础。【方法】采集感染和未感染鸡白痢沙门氏菌的SPF雏鸡脾脏，提取脾脏RNA，构建6个miRNA文库；利用Illumina Hiseq 2500测序技术和生物信息学分析筛选差异表达miRNA，通过TargetScan和miRanda算法预测差异表达miRNA的靶基因，并进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，最后利用RT-qPCR方法验证测序结果。【结果】鉴定到29个差异表达miRNAs，其中15个显著上调、14个显著下调。GO分析表明：脂多糖介导的信号通路正调控以及NIK/NF-κB介导的信号通路负调控等免疫相关生物学过程显著富集；KEGG分析显示：差异表达的miRNA主要参与溶酶体和内吞作用等免疫相关通路。高通量测序结果与RT-qPCR结果一致。【结论】成功鉴定到鸡白痢沙门氏菌感染雏鸡脾脏miRNA表达谱，获得29个鸡白痢沙门氏菌感染潜在相关miRNAs。     

草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用

 【目的】探讨草莓EST序列中SSR位点的分布规律,开发草莓EST-SSR引物,并分析其在草莓品种遗传多样性研究中的应用。【方法】从NCBI公共数据库下载草莓表达序列标签（expressed sequence tag,EST）55 750条,利用MISA软件查找SSR位点,并利用Primer3.0 Plus软件设计60对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物进行克隆和测序,以验证其真实性。【结果】55 750条草莓EST序列含有SSR位点的序列1 334条,SSR位点1 490个。其中,二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占36.17%、26.51%和19.87%。60对引物中有42对引物能在20个草莓品种中扩增出理想的PCR产物,其中36对引物扩增条带具有多态性。利用11对验证的EST-SSR引物分析了20个草莓品种的亲缘关系。【结论】草莓EST-SSR标记的开发对于草莓品种鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

草莓miR156靶基因SPL9的克隆与表达分析

 【目的】从草莓中克隆SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子基因SPL9,并分析其在草莓植株不同生长时期的表达水平及与miR156的表达关系,探讨SPL9在草莓植株生长发育中的作用。【方法】根据苹果SPL基因家族的保守序列设计简并引物,以草莓叶片为试材,利用RT-PCR克隆草莓SPL9基因片段,在此基础上利用RACE方法克隆SPL9的cDNA全长。利用实时定量RT-PCR技术分析草莓叶片中SPL9及miR156的表达水平。【结果】从草莓（Fragaria×ananassa）品种‘全明星’中克隆出SPL9基因的cDNA全长序列,命名为FaSPL9。其CDS长度为1 143 bp,编码381个氨基酸,与拟南芥AtSPL9、葡萄VvSPL9、枳PtSPL9、苹果MdSPL9以及玉米ZmSPL9的氨基酸序列同源性分别为：40.30%、64.57%、56.09%、70.33%,38.35%。FaSPL9有着高度保守的SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。FaSPL9基因序列中包含miR156的靶位点,实时定量RT-PCR结果表明,在草莓植株的不同生长时期FaSPL9的表达量不同,且与miR156呈现相反的表达模式。【结论】从草莓中分离出FaSPL9基因,其作为miR156的靶基因,推测FaSPL9对草莓植株的生长发育具有重要的调控作用。     

新疆地区四种草莓病毒病原的检测

【目的】研究新疆草莓病毒病病源种类及田间发生情况,建立主要病毒病原多重RT-PCR检测体系,为无病毒草莓生产提供理论和技术支持。【方法】利用已报道的4种草莓主要病毒病原4对特异性引物,分别对新疆主要草莓种植区采集表现疑似病毒病症状的草莓样品共450份,采用单一反转录PCR(RT-PCR)及多重PCR对采集的样品进行检测,分析新疆草莓病毒病的发生情况。【结果】感染新疆草莓有3种主要病毒,南北疆15个不同栽培区均能检测出这3种病毒,每个采集地的病毒检出率均在26%以上。所有样品中病毒总检出率为64.22%;其中,草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)检出率最高,为51.78%;草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)检出率为23.78%,草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)检出率为9.33%,草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)没有检出。病毒复合侵染率达18.45%,两种病毒病复合侵染检出率为16.67%,三种病毒病复合侵染检出率为1.78%;所有样品中对3种病毒的多重RT-PCR与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】新疆草莓受SVBV、SMoV和SMYEV三种病毒危害,单一病毒病感染率以及两种以上病毒复合侵染侵染率都较高,在无病毒种苗的培育和生产中加强病毒检测。     

DHAR与草莓AsA积累关系及DHAR RNAi遗传转化研究

[目的]确定草莓脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)酶活性与抗坏血酸(ASA)的关系,研究DHAR对AsA积累的调控作用,为筛选高AsA草莓品种育种提供理论基础.[方法]于不同时期测定草莓果实AsA含量和DHAR酶活性并进行相关性分析,构建DHAR基因RNAi植物表达载体,通过农杆菌介导法,将RNAi植物表达载体导入草莓中.[结果]草莓果实成熟过程中AsA含量呈现上升趋势,生长后期含量增幅最大.随着草莓果实的成熟,DHAR酶活性逐渐增大,在生长后期酶活性最高.构建了脱氢抗坏血酸酶基因(DHAR)的RNAi植物表达载体(Part27-Ⅰ DHAR),并采用农杆菌介导法转入草莓,共获7株PCR阳性植株,初步说明目的基因已整合到草莓组织中.[结论]DHAR酶活性与AsA积累呈显著正相关,获得的转基因植株可为下一步研究提供植物材料.     

4种纤维头对草莓香气成分的萃取效果

【目的】研究不同固相微萃取纤维头对草莓香气成分的萃取效果和质谱数据的自动鉴定方法,为草莓品质育种及其深加工提供一种简单、准确的研究方法。【方法】采用固相微萃取-气相色谱/质谱-自动质谱解卷积鉴定系统检测成熟草莓果实中的香气成分。【结果】在成熟草莓果实中共检测到97种香气成分,主要成分为酯类、醇类、酮类和萜烯类化合物,分别占已检出香气成分总数的42.3%、13.4%、10.3%和6.2%。草莓的特征香气成分至少有8种,根据贡献大小,依次为丁酸乙酯、己酸乙酯、沉香醇、呋喃酮、丁酸甲酯、己酸甲酯、2-庚酮和橙花叔醇。50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头的灵敏度最高、检出的物质最多,其余依次是100μm PDMS纤维头、85μm PA和7μm PDMS。4种固相微萃取纤维头对酯类物质均有较好的萃取效果,50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头对酮类、萜烯类、醇类和醛类物质的萃取效果明显高于其它纤维头。【结论】50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头较适用于草莓香气成分的萃取。自动质谱解卷积鉴定系统处理鉴定质谱数据具有灵敏度高、准确性好、速度快的特点,值得推广应用。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

应用Solexa测序技术挖掘山羊卵巢组织microRNA

【目的】旨在构建、分析山羊卵巢组织miRNA表达谱,为进一步研究特定miRNA与山羊卵泡发育及性激素分泌等相关生殖活动的关系奠定理论基础。【方法】首先从山羊卵巢组织总RNA中分离小片段RNA,然后进行Solexa测序和生物信息学分析,最后利用q-PCR技术验证miRNA在山羊卵巢组织中的表达。【结果】共鉴定出508个山羊卵巢组织表达的miRNA和19个对应的miRNA*,这些miRNA在哺乳动物（绵羊、牛、猪、马、狗）进化过程中高度保守;q-PCR验证了8个miRNA在山羊卵巢组织中的表情况,定量结果与测序结果一致。【结论】成功构建了山羊卵巢组织miRNA表达文库,山羊卵巢组织miRNA表达丰富且其表达量各异。