牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究

基于对RNA二级结构的预测和密码子偏性计算,通过计算机辅助软件进行牛IFN-α基因优化,经人工合成优化后的基因与pWL表达载体连接后诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,其产物分子量约为17ku,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的33％,表达产物以包涵体形式存在。经过包涵体溶解、初步复性后利用CM Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用梯度法进行牛α-干扰素包涵体蛋白质的纯化复性。结果表明,梯度离子交换层析法能有效地复性牛α-干扰素包涵体,复性后的重组牛α-干扰素的纯度达95％,通过离子交换层析柱纯化和复性后,重组牛α-干扰素在MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性为5．56×10^6 u／mg。     

猪葡萄球菌ExhB基因在E．coli中的表达及生物学活性分析

以猪葡萄球菌基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ExhB基因,克隆测序鉴定后,插入质粒pET32a,构建重组表达载体pET32a-ExhB,通过大肠杆菌BL21表达重组融合蛋白,利用Ni亲和层析的方法纯化重组的融合蛋白,并用纯化的蛋白攻毒裸鼠,鉴定其生物学活性.结果显示,扩增出了猪葡萄球菌ExhB基因并纯化出了重组的融合蛋白,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白的相对分子质量约为45 000,主要以包涵体形式存在;通过ELISA和琼脂扩散试验表明,所表达的包涵体蛋白可以与用菌体制得的多克隆抗血清发生特异性结合;用复性的蛋白在裸鼠身上攻毒后可以产生皮炎病变.结果表明,成功的表达了ExhB基因的重组融合蛋白,并且鉴定出重组蛋白可与猪葡萄球菌阳性血清发生特异性免疫反应和重组蛋白在裸鼠身上的致病性,为进一步研究猪葡萄球菌的致病机理及建立该菌完备准确的防治和检测方法奠定基础.     

猪白细胞介素-6基因的非融合原核表达研究

用DNA重组技术，将已克隆的猪IL-6基因阅读框片段插入非融合原核表达质粒pBV220中的适当位置，获得重组质粒pBVpIL-6，转化大肠杆菌DH5α后，42℃诱导阳性表达菌。经SDS-PAGE检测发现目的蛋白获得了高效表达，表达量约占总蛋白的20％。表达的蛋白以包涵体形式存在，包涵体经过变性溶解和复性后用酶联免疫吸附试验（ELISA）做定性定量检测。ELISA结果证实了所表达的蛋白为猪IL-6，复性后具有一定活性．并测出了复性后活性蛋白的浓度。     

口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达

将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

水泡性口炎病毒N蛋白原核表达及免疫原性分析

本研究旨在克隆和表达水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）特异性抗原N蛋白,进而纯化并分析其免疫原性。根据GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV两种不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引物,PCR扩增获得约1 300 bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pCold Ⅰ原核表达载体中,经IPTG诱导表达后,采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化重组N蛋白。SDS-PAGE分析表明,N基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为50 ku;Western blotting检测结果表明,该重组蛋白与VSV多克隆抗体发生特异性反应。本试验成功构建了VSV-IND和VSV-NJ的原核表达载体,实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

犬干扰素α2的原核表达及抗病毒活性分析

本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组Ca IFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/m L。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。     

猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础.     

兔视黄醇结合蛋白4基因的克隆及原核表达

为表达兔视黄醇结合蛋白4(rRBP4),提取兔肝脏组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增了rRBP4的基因,大小为606bp。将其克隆于原核表达载体pET-32a(+)获得表达重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21(DE3)Plyss中进行表达,pET-32a-rRBP4以包涵体形式表达,包涵体经过洗涤、变性后,用镍离子亲和层析柱纯化,并利用尿素梯度透析法复性。SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子质量一致的特异性目的蛋白;Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

猪白细胞介素-4重组蛋白的纯化及其生物学特性分析

用已构建好的重组表达载体pGEX-4T-IL-4转染E.coli,在最适条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表达出38 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的25%,表达产物主要以包涵体的形式存在;对表达产物经变性、复性及初步纯化后再结合饱和硫酸铵沉淀和Sephadex-G100凝胶层析柱进一步纯化,所得蛋白的纯度约在90%以上。在体外利用MTT法检测其生物学特性,结果表明其具有较好的生物学活性,本试验为获得猪IL-4重组蛋白奠定了基础。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白的原核表达与鉴定

参照已发表的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增长约972 bp的E基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

表达牛呼吸道合胞体病毒G蛋白基因的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建与鉴定

为构建表达牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白基因的牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)重组病毒,本研究将人工合成的BRSV全长G蛋白基因编码序列插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建TK基因缺失转移载体。利用磷酸钙-DNA沉淀法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过反向蚀斑筛选,得到重组病毒BHV-1/TK-/G+。PCR检测结果证实G蛋白基因已经插入到了亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组中,间接免疫荧光试验和western blot证实BHV-1/TK-/G+中的G蛋白基因在感染的细胞中获得了表达。本研究为研制BRSV及其他重要牛传染病的BHV-1病毒活载体疫苗奠定了基础。     

番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定

纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液,通过ＰＣＲ技术,从病毒ＤＮＡ中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３完整编码基因。将该ＰＣＲ扩增片在ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅡ位点克隆进ｐＵＣ１８质料载体,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３,进一步对该片段进行序列及用ＣＬＯＮＥ软件分析该序列。结果结盟,其与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ３编码基因的克隆。     

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗原区原核表达及反应原性鉴定

本研究旨在获得重组牛呼吸道合胞体病毒（BRSV） G蛋白并对其进行反应原性鉴定。从NCBI上找出G基因的核苷酸序列，分析其抗原区域，利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段，将目的片段连接到克隆载体pMD19-T后，对其进行双酶切鉴定和测序。将双酶切后的目的片段进行胶回收，构建重组质粒pET-32a-G，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用Ni-IDA亲和层析法纯化经IPTG诱导表达的蛋白，并测定其浓度；通过SDS-PAGE和Western blotting方法对该蛋白进行分析与鉴定。结果显示，本试验成功克隆出大小约为567 bp的G基因，获得分子质量约为40 ku的可溶性重组蛋白，优化诱导条件后用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定，在16℃、IPTG浓度1.2 mmol/L、诱导4 h时蛋白表达量最大；通过Western blotting检测发现，重组蛋白可与山羊源BRSV标准阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有反应原性。综上，本研究成功表达并纯化了BRSV G蛋白，为建立BRSV抗体间接ELISA检测方法和BRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。     

羊传染性脓疱病毒趋化因子结合蛋白（CBP）基因的克隆及表达分析

参照GenBank中ORFV的毒力因子CBP基因的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增该基因片段,并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,经PCR、酶切鉴定和测序正确后,转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG进行诱导表达,并通过生物信息学软件进行分析。SDS-PAGE结果可见大小...     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致。基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1mL。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

本研究根据GenBank数据库中的猪圆环病毒2型全基因组序列设计并合成了1对能扩增完整Cap序列的引物,采用PCR扩增猪圆环病毒2型YZ株的Cap基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBacHTA-Cap;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有Cap基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap转染sf9昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒rBacmid-Cap,该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒2型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.     

布鲁菌OMP25基因重组山羊痘病毒的构建

将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游,构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞,在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化,经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。