中药复方制剂治疗急性感染弓形虫小鼠的效果研究

观察研制的中药复方制剂治疗急性感染弓形虫小鼠的效果。在测定感染弓形虫小鼠最小致死量的基础上,比较不同剂量的中药复方制剂(35、25和15 g/kg)和磺胺间甲氧嘧啶钠(300、200和100 mg/kg)的疗效。为进一步验证治疗剂量的效果,每只鼠经腹腔感染25个弓形虫速殖子后4 h,鼠逐只经胃灌服25 g/kg中药复方制剂或200 mg/kg磺胺间甲氧嘧啶钠,每日2次,连用5 d,同时设感染不用药组与空白对照组,以小鼠存活率与平均存活时间、腹腔液中虫体数、组织病变程度以及SOD活性等指标评价药物效果。不同剂量治疗效果的比较显示,中药高剂量组、中剂量组与磺胺间甲氧嘧啶钠中剂量组的小鼠存活率、平均存活时间及腹腔液中虫体数相近,三者间差异不显著(P>0.05)。验证试验显示,中药复方制剂组(25 g/kg)与磺胺间甲氧嘧啶钠组(200 mg/kg)的小鼠存活率、平均存活时间、腹腔液中虫体数和血清SOD活性相近,两者间无显著差异(P>0.05),两者均能减轻肝、肺、脾的组织病变。中药复方制剂具有一定的抗弓形虫效果,25 g/kg的剂量效果最佳。     

牦牛脾脏非特异性转移因子对小鼠抗衰老作用的影响

构建小鼠亚急性衰老模型,注射牦牛脾脏非特异性转移因子(n TF),采用试剂盒检测衰老小鼠组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,以研究n TF的抗氧化作用。结果:药物组小鼠的心、肝、肺、肾组织中SOD酶活性与阳性对照组相比有增加的趋势,但各组间差异不显著(P0.05);小鼠心、脾、肾组织中MDA含量显著低于阳性对照组,差异显著(P0.05);药物组小鼠心、肝、脾、肾组织中GSH-Px酶活性显著高于阳性对照组,差异显著(P0.05)。试验表明,注射n TF衰老小鼠组织中GSH-Px酶活性显著增加,同时MDA含量显著降低,表明n TF能有效增强机体抗氧化的作用及降低机体受自由基攻击的程度。     

刚地弓形虫PTS核酸疫苗的构建及免疫保护力评价

旨在构建弓形虫磷脂酰苏氨酸合成酶(Toxoplasma gondii phosphatidylthreonine synthase,PTS)基因DNA疫苗,评价其抗弓形虫的免疫保护力。利用RT-PCR技术扩增得到弓形虫PTS基因,构建真核表达质粒pVAXTgPTS,然后转染HEK 293-T细胞,分析pVAX-TgPTS在细胞中的表达情况。利用真核表达质粒pVAX-TgPTS对BABL/c小鼠进行3次免疫,并用空质粒pVAX1作为对照,在每次免疫前和第3次免疫后2周收集小鼠血清,经ELISA方法检测小鼠血清中的IgG水平。第3次免疫后2周每组取3只小鼠,将其剖杀取脾脏,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪测定CD4+和CD8+T细胞百分比。小鼠脾细胞经STAg刺激后,利用ELISA试剂盒检测脾细胞细胞因子的表达情况。第3次免疫后2周,每只小鼠腹腔注射1 000个弓形虫RH株速殖子,观察记录小鼠的存活时间。结果显示,pVAX-TgPTS能够在HEK 293-T细胞中表达;第3次免疫后2周pVAX-TgPTS组血清中IgG含量相比对照组有了显著提高;pVAX-TgPTS组淋巴细胞刺激指数(SI)略微高于对照组;CD4+和CD8+T细胞百分比含量明显高于对照组;pVAX-TgPTS组中脾细胞经STAg刺激后能够明显提高IFN-γ的表达量。攻虫试验结果表明,pVAX-TgPTS组小鼠存活时间比对照组明显增长。本试验成功构建真核表达质粒pVAX-TgPTS,证明pVAX-TgPTS能够诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应,并对弓形虫感染产生一定程度的免疫保护力,该研究结果为进一步研发弓形虫核酸疫苗奠定基础。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

5种中药对急性感染弓形虫小鼠的治疗效果

首先,测定感染小鼠最小致死量;然后,通过体内安全性试验确定各种药物治疗剂量;最后,评价5种中药对急性感染弓形虫小鼠的治疗效果,即:各药物组每只小鼠经腹腔感染25个弓形虫速殖子后4h,小鼠逐只经胃灌服剂量为25g/kg的白牛胆、垂花香薷、黄皮叶或桦褐孔菌,或10.4mg/kg蟾酥、200mg/kg磺胺间甲氧嘧啶钠,每日2次,连用5d,同时设感染不用药组和空白对照组,以小鼠存活率与平均存活时间、腹腔液中虫体数、组织病变程度以及SOD活性等指标评价药物效果。结果显示,磺胺间甲氧嘧啶钠、蟾酥、桦褐孔菌、黄皮叶、白牛胆、垂花香薷组的小鼠存活率分别为66.67%、61.11%、50.00%、5.56%、0%和0%。蟾酥、桦褐孔菌与磺胺间甲氧嘧啶钠组的小鼠平均存活时间、腹腔液中虫体数和血清SOD活性相近,三者间无显著差异(P0.05),均显著好于黄皮叶、白牛胆、垂花香薷和感染不用药组(P0.05)。在磺胺间甲氧嘧啶钠组和蟾酥组在肺脏仅出现肺泡隔毛细血管轻微充血,在肝脏和脾脏无明显病变或病变不明显;桦褐孔菌组的肝脏也无明显病变;其他治疗组的脾脏均有不同程度坏死。结果表明,蟾酥与桦褐孔菌的抗弓形虫效果与磺胺间甲氧嘧啶钠相近,白牛胆、垂花香薷和黄皮叶的抗弓形虫效果不明显。     

三株弓形虫对昆明鼠致病性的比较研究

刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,弓形虫属仅有刚地弓形虫一种,但世界各地的分离株有着丰富的遗传多样性。作者以Ⅱ型(Pru、BJ)和Ⅲ型(VEG)虫株为研究对象,通过腹腔接种昆明小鼠,观察小鼠的临床表现,检测血清抗体水平、弓形虫在组织器官的动态分布及脑荷虫量等指标,比较不同虫株对小鼠致病性的差异。结果显示:Ⅱ型虫株接种小鼠表现出更明显的临床症状。监测小鼠血清抗体变化发现,Ⅱ型虫株感染小鼠在第4天即检测到弓形虫特异性抗体,随后抗体水平至第64天持续上升,感染Ⅲ型虫株小鼠血清在感染后第32天达到峰值并维持在较高水平。并且,三种虫株在小鼠组织器官的动态分布趋势大体相同,感染早期(第1天)侵染肺、肾、肌肉,中期(第8天)多分布在心、肺、肌肉、脑中,后期(第32天)存在于脑中,脾、肾、肝中不易检测到虫体。成功建立了三种弓形虫虫株感染昆明小鼠模型,证明Ⅱ型和Ⅲ型虫株对昆明鼠致病力的具体差异,并发现不同基因型弓形虫速殖子感染小鼠后在小鼠体内的分布随时间呈现一定的规律性,为弓形虫致病力的研究和动物模型的建立提供参考。     

实验肝片吸虫感染对大鼠机体自由基代谢影响的研究

通过大鼠感染肝片吸虫复制感染模型 ,研究肝片吸虫感染后血清抗氧化功能的变化。 60只大鼠随机分成感染组和对照组 ,每组 30只。感染组大鼠一次口服 2 5个囊蚴 ,对照组不感染。于感染前 (0周 )和感染后 (1 ,3,5,7,9周 )采集血样 ,检测感染后谷胱甘肽过氧化物酶(GSH Px)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (CAT)活性和丙二醛 (MDA)含量的变化。结果表明大鼠感染肝片吸虫后 ,感染组血清中GSH Px先升高后下降 ,SOD活性无明显变化 ,CAT活性在感染后下降 ,MDA含量在前 5周变化不明显 ;说明自由基参与了肝片吸虫病的发病过程     

肠炎沙门菌感染对鸡血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响

研究通过检测鸡感染肠炎沙门菌(SE)后血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量的变化,探讨氧化损伤与SE感染的关系。将90只1日龄肠炎沙门菌阴性SPF鸡随机分为两组,对照组40只接种PBS,试验组50只接种肠炎沙门菌菌液。分别于接种后第1、3、7、14及21天进行屠宰,收集血清,检测血清中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的变化。结果显示:接种后第1、3、7及21天,试验组SOD及GSH-Px活性均显著高于对照组(P0.05),试验组及对照组中MDA含量差异不显著;组内不同时间点间比较表明,SOD、GSH-Px活性及MDA含量均存在波动性。由结果可知,肠炎沙门菌感染后鸡血清SOD、GSH-Px活性增强,提高了机体抗氧化能力和清除过氧化物的能力,保护了细胞免受损伤。同时血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量波动变化表明机体对SE感染的氧化损伤调控具有时效性。     

葛根素对摘除卵巢小鼠血清激素含量的影响

目的:阐明葛根素对摘除卵巢小鼠血清中几种激素含量的影响。方法:40只21日龄雌性小鼠建立摘除卵巢模型,将其分为阴性对照组、试验组(葛根素组)、阳性对照组Ⅰ(己烯雌酚组)和阳性对照组Ⅱ(己烯雌酚+孕酮混合组),另外设正常对照组、每组10只,共50只小鼠。正常对照组和阴性对照组蒸馏水灌胃;试验组葛根素水溶液(1 mg/mL)灌胃;阳性对照组Ⅰ己烯雌酚悬浮液(20μg/mL)灌胃;阳性对照组Ⅱ己烯雌酚悬浮液(20μg/mL)和黄体酮注射液(20 mg/mL)混合灌胃。隔日给药一次,各组每次每只0.1 mL,连续给药3周。给药结束后采血,采用放射免疫法测定小鼠血清中激素含量。结论:摘除卵巢小鼠血清中雌二醇、孕酮含量显著降低,生长激素含量显著升高,而血清催乳素含量无明显变化。葛根素对摘除卵巢小鼠血清雌二醇、催乳素含量无明显影响,但能够影响摘除卵巢后血清中孕酮含量,使之基本恢复到摘除卵巢前水平,并能显著抑制卵巢摘除所引起的血清生长激素含量过高,并使其恢复到正常水平。     

螺旋藻复合多糖与银杏提取物对小鼠耐缺氧能力的影响

将螺旋藻多糖(PSP)与银杏叶提取物(GBE)按不同比例复合,以每日200mg/kg剂量分别灌服小鼠,给药14d后制作小鼠常压密闭缺氧模型,观察小鼠缺氧存活时间,检测心、肝、脑组织MDA含量,肝、脾SOD活力等生化指标。结果表明,供试药物均可延长小鼠在常压密闭缺氧条件下的存活时间,提高缺氧小鼠肝、脾SOD活力,降低缺氧小鼠心、肝、脑组织MDA含量。说明本试验的供试药物均具有一定的抗疲劳作用。PSP与GBE以2∶1比例复合使用对提高小鼠的抗疲劳能力能产生较好的协同增效作用。     

桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响

为探讨桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响,采用弓形虫RH株感染雌性性成熟小鼠,以蒿甲醚为阳性对照组,桦褐孔菌多糖为试验组,并设立阴性组和模型组.观察孕鼠胎儿的死胎散、体重、体长等发育指标,同时记录剖检前各组孕鼠死亡数和受孕数,并对孕鼠的生殖器官进行病理组织观察.经统计分析,桦褐孔菌多糖组与模型组在孕鼠死亡率和受孕率方面差异极显著(P＜0.01);在死胎率、活胎鼠平均体重、活胎鼠平均体长方面差异也极显著(P＜0.01);而两药物组仅在受孕率方面显著差异(P＜0.05),其孕鼠生殖器官的病理组织仅呈轻微的炎症变化.表明桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠的胎鼠发育具有保护作用;并可明显缓解弓形虫感染对孕鼠生殖机能的损害.     

Protective immunity to toxoplasmosis in pigs vaccinated with a nonpersistent strain of Toxoplasma gondii

The RH strain of Toxoplasma gondii is highly virulent; 1 infective organism is uniformly lethal for mice. Three pigs inoculated SC with 10(3) tachyzoites of the RH strain developed fever, but otherwise remained normal, and T gondii was not demonstrated in their tissues by bioassay into mice. To determine whether vaccination with the RH strain could induce protective immunity to oral challenge with T gondii oocysts, 12 pigs were divided into 3 groups (A, B, C) of 4 pigs each. Pigs in groups A and B were inoculated IM with 10(6) tachyzoites of the RH strain and 4 pigs in group C served as uninoculated controls. Except for fever, the pigs remained clinically normal after inoculation with the RH strain and T gondii was not found by bioassay in mice of tissues from 4 pigs euthanatized 64 days after inoculation. Pigs in groups B and C were challenge-inoculated orally with 10(4) (4 pigs) or 10(5) (4 pigs) T gondii oocysts 72 days after vaccination with the RH strain. The previously uninoculated pigs developed fever, anorexia, and diarrhea from 3 to 8 days after the oocyst challenge. One of the 2 pigs given 10(5) oocysts became moribund because of toxoplasmosis and was euthanatized 9 days after inoculation. Pigs vaccinated with the RH strain remained free of clinical signs after challenge with oocysts. Results of the bioassays indicated that fewer tissue cysts developed in the RH strain-vaccinated pigs than in the previously uninoculated control pigs.     

桦褐孔菌多糖对弓形虫感染小鼠基因表达谱的影响

探讨桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠基因表达谱的影响,并对其抗虫机理进行分析。BABL/C小鼠腹腔接种RH株弓形虫速殖子103个,建立小鼠弓形虫感染模型。将小鼠随机分成3组:空白对照组、感染对照组、桦褐孔菌多糖治疗组。采集动物肝脏迅速冻存,提取总RNA,检测RNA质量,扩增RNA,进行芯片杂交,扫描后进行数据分析。结果:经SOM分析筛选出桦褐孔菌多糖治疗组的有效差异基因,并对其进行功能注释,分析其治疗弓形虫的主要原因。结果表明:桦褐孔菌多糖可有效治疗弓形虫感染引起的病理损伤,其抗弓形虫机理是通过调节宿主细胞因子水平,促进Th1/Th2平衡,控制Toll样受体信号通路以及对机体整体调控达到抗弓形虫目的。     

Toxoplasmosis in sheep. Haematological serological and parasitological studies.

Blood variables (cell values, contents of haemoglobin, minerals and proteins) were studied retrospectively in 13 lambs which had acquired toxoplasmosis during the summer, and in 2 lambs which had been infected during the perinatal period. Examination by immunoelectrophoresis was also performed. The lambs had been in experimental groups in a research project of blood values in sheep on pastures of different qualities. The groups comprised a total of 40 lambs, which had been bled once monthly. Examinations were also carried out in lambs experimentally infected with the RH strain of T. gondii, in lambs experimentally infected with a sheep strain of the parasite, and in a control group. No significant changes in the blood variables were found.Meat samples from the experimentally infected lambs and their controls were examined parasitologically. T. gondii was recovered from all dye test positive (titre ≥ 1/16) lambs inoculated with the sheep strain, but not from any of the lambs inoculated with the RH strain. The results indicated that the RH strain does not produce cysts in the muscular tissue in sheep. Some observations indicated that this strain may protect against reinfection with other strains, but the number of individuals was too low for a statistical conclusion. kw|Keywords|k]toxoplasma infection; k]haematology; k]sheep {fn1|This work was supported by grants from The Norwegian Research Council for Science and for the Humanities.}     

弓形虫MORN2基因敲除株的构建及其表型鉴定

本研究旨在构建弓形虫（Toxoplasma gondii）Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2（membrane occupation and recognition nexus protein，MORN2）基因敲除株，探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物，以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板，在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒；在MORN2靶点两翼约500 bp设计同源臂引物，以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因（DHFR）的同源片段；将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中，进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示，试验成功获得MORN2基因敲除株，在体外噬斑试验中，该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致；在体内感染试验中，分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠，小鼠的死亡时间与对照组基本一致，说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能，为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。     

弓形虫感染鼠脾细胞microRNA表达谱的检测分析

MicroRNA（miRNA）是一类约22个核苷酸组成的单链非编码RNA,在分化、发育、肿瘤形成等方面起着重要作用。本研究对弓形虫RH株感染小鼠脾细胞miRNA的表达进行了特异性基因芯片检测分析,并应用荧光定量RT-PCR方法进行验证。结果表明,感染鼠脾细胞中与免疫应答及细胞增殖和肿瘤发生相关的三大类miRNA中,有39种表达下调,同时有36种表达上调。上述结果揭示,弓形虫感染机体后伴随着靶细胞功能性miRNA表达谱的显著改变,这为进一步研究弓形虫感染致病的分子机制开辟了新的方向。     

Immunogenicity and protective efficacy of two recombinant pseudorabies viruses expressing Toxoplasma gondii SAG1 and MIC3 proteins

Toxoplasma gondii is one of the most common parasitic pathogens in humans and warm-blooded animals, causing toxoplasmosis. One of the efficient ways to control this disease is immunization. In this study, two recombinant pseudorabies virus (PRV) expressing TgSAG1 (rPRV-SAG1) and TgMIC3 (rPRV-MIC3) based on the PRV vaccine strain were developed by homologous recombination and used for immunizing BALB/c mice. Ninety BALB/c mice were randomly divided into five groups including four experimental groups (inoculated twice in 4 weeks interval with PRV TK-/gG-/EGFP+, rPRV-SAG1, rPRV-MIC3, rPRV-SAG1+rPRV-MIC3, respectively) and one control group (inoculated with medium). All mice vaccinated with rPRV developed a high level of specific antibody responses against T. gondii lysate antigen (TLA), a strong increase of the splenocyte proliferative response, and significant levels of IFN-γ and IL-2 production. These results demonstrated that rPRV could induce significant humoral and cellular Th1 immune responses. Moreover, rPRV immunization induced partial protection against a lethal challenge with T. gondii RH strain, and neutralizing antibodies against PRV in a BALB/c mouse model. The mice immunized with the rPRV-SAG1 and rPRV-MIC3 cocktail could develop higher T. gondii-specific IgG antibodies and lymphocyte proliferative responses and conferred more efficient protection against T. gondii challenge. These results suggested that expression of protective antigens of T. gondii in PRV is a novel approach towards the development of a vaccine against both animal pseudorabies and toxoplasmosis.     

桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠治疗作用及其对血清中细胞因子含量的影响

建立小鼠弓形虫病模型后,将小鼠随机分成6组,统计小鼠存活率及时间,再应用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-2等细胞因子水平,以检测桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠的治疗效果及对小鼠血清中IFN-γ、IL-2细胞因子水平的影响。结果表明,桦褐孔菌多糖中剂量组小鼠存活率最高;桦褐孔菌多糖的高、中剂量组IFN-γ水平极显著高于其他各组(P<0.01),高剂量组IL-2水平与其他各组比较差异极显著(P<0.01);除感染组外,其余各组IFN-γ、IL-2均在第6天出现峰值。说明桦褐孔菌多糖中剂量治疗弓形虫感染小鼠效果最好,并且中剂量可使小鼠血清中IFN-γ、IL-2值升高到适当水平,有效改善弓形虫感染对小鼠的伤害。     

猪弓形虫特异性PCR诊断方法的建立及应用

以猪弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列为模板自行设计引物,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法,并从弓形虫国际标准强毒株RH速殖子和疑似T.gondii感染猪全血及肺脏组织样品基因组DNA中扩增出了预期长度273bp的目的DNA片段。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法能检测到的最低DNA量为0.001ng,且与相关的9种对照寄生虫、细菌和病毒无交叉反应。用建立的PCR诊断方法对临床30份猪弓形虫疑似病料和60份健康猪抗凝全血样品进行检测,结果30份病料中有24份呈现阳性;60份健康猪血中有5份为阳性;随机取两个临床样品的阳性PCR扩增片段进行克隆测序表明,二者序列与Gen-Bank中已登录的猪弓形虫ITS1基因相应部分序列完全相同。以上表明所建立的PCR方法具有高度的敏感性和特异性;本研究为猪弓形虫病的快速诊断提供了一种新方法。