Ilk对LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞分泌炎性因子的影响

为探究Ilk对LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞(MECs)分泌炎性因子IL-8、TNF-α的影响,采用siRNA技术筛选最佳转染条件,q PCR法和ELISA法检测siRNA转染后下游蛋白Akt1的表达来评价Ilk沉默,ELISA法检测Ilk沉默后对小鼠MECs分泌炎性因子IL-8、TNF-α的影响。结果显示:选用Ilk-mus-595片段的20 n M转染组可极显著抑制Ilk的mRNA表达(P0.01),转染效率最好,达84.83%;Ilk转染后可显著减少LPS介导的Akt1 mRNA的转录和蛋白表达(P0.05);可显著减少LPS介导的TNF-α分泌(P0.05),但各组IL-8的量无变化(P0.05)。结果提示:利用siRNA成功转染的Ilk可以影响细胞内Akt1的表达,降低细胞分泌的TNF-α含量,Ilk可能与小鼠MECs的抗炎有关,可作为靶基因进行更加深入的研究,以期为乳腺炎症的治疗提供新的思路及数据参考。     

RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响

旨在研究RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响,明确抑制素对绵羊颗粒细胞的局部调节作用,为今后提高动物的繁殖力奠定基础。选用1.0~1.5岁的小尾寒羊,从卵泡(3~7mm)中分离培养颗粒细胞,将siINHα和siNC(阴性对照)转染颗粒细胞,以未转染的细胞为空白对照(Control),利用脂质体介导法进行转染,荧光定量RT-PCR检测INHα基因的沉默效率、细胞周期和凋亡相关基因的变化,流式细胞仪检测细胞周期的分布变化。结果表明,siRNA转染绵羊颗粒细胞48h后,INHα基因的沉默效率达85%以上。与阴性对照相比,细胞周期相关基因Cyclin D1和CyclinB1mRNA的表达水平分别降低了0.2倍和0.7倍(P0.05),而p21的mRNA表达水平升高了0.9倍(P0.05);细胞凋亡通路中的促凋亡因子Bax、p53和Caspase3的mRNA表达量分别升高了1.8倍、3.6倍和0.4倍(P0.05),而抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达量不受影响,阴性对照与空白对照差异不显著(P0.05)。与阴性对照相比,细胞周期的分布显著改变,干扰组G1细胞比例显著升高(P0.05),S期细胞比例显著降低(P0.05),而阴性对照与空白对照间无显著差异(P0.05)。综上表明,INHα作为绵羊颗粒细胞中关键的调控因子,通过调控绵羊颗粒细胞的生长和凋亡参与调控绵羊卵泡排卵的过程。     

生长抑素基因靶向siRNA表达载体的构建及对生长抑素基因表达的抑制作用

合成含靶向生长抑素（Somatostatin,SS）前体基因的siRNA转录模板的发夹结构,插入pSilencerTM2.1-U6载体构建重组质粒2.1-S。提取小鼠下丘脑组织总RNA,PCR扩增获得SS前体基因cDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1-SS、pEGFP-SS。将2.1-S分别与pcDNA3.1-SS、pEGFP-SS共转染入细胞中瞬时表达,检测SS前体基因表达变化。结果显示,重组质粒在E.coli（DH5α）内扩增,酶切及测序鉴定证明siRNA转录模板完整,正确地插入到pSilencerTM2.1-U6质粒中,重组质粒pcDNA3.1-SS与pEGFP-SS经测序序列完全正确。转染细胞在mRNA水平及蛋白水平均检测到2.1-S对SS前体基因表达的抑制。这表明,SS基因靶向siRNA稳定表达载体能在哺乳动物细胞中表达,并对靶基因呈抑制作用。     

小鼠IGFBP-6基因shRNA的设计与筛选

胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP-6)是胰岛素样生长因子结合蛋白家族(IGFBPs)的一员,IGFBP 6不同于IGFBP1 5,其与IGF-2的亲和力显著的优先于IGF-1,受到研究者的广泛关注.本研究在小鼠IGFBP-6基因mRNA的806、760和908 bp处找到潜在靶位点,设计3条shRNA干扰载体,并合成DNA Oligo,体外退火成双链DNA,插入pGU6/GFP/Neo载体,获得3条针对目的基因不同靶序列的干扰载体,瞬时转染NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞48 h后,利用流式细胞技术分选收集转染重组载体的细胞,提取细胞总RNA和蛋白质,实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法分别检测目的基因mRNA水平,蛋白水平对IGFBP-6的表达.结果表明,IGFBP-6(IGFBP-6,806-826)表现出了最高的干扰效率,转染效率为(79.2±2.3)％时,mRNA水平的沉默效率达(68.9±12.2)％,(P＜0.05);蛋白质水平的沉默效率达(46.7±11.3)％,(P＜0.05).本试验为研究IGFBP-6基因对细胞增殖的作用和体内生物学功能奠定了基础.     

猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定

本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具.     

注射pGRF基因质粒对猪血清生长轴激素变化规律的影响

本研究旨在探讨注射pGRF基因质粒在猪体内的表达效应及作用规律.试验选择8头体质量相近((15 0.43)kg)的健康长白×大白二元杂交阉公猪,随机分成2组.试验组颈部肌肉注射含4.5 mg pGRF基因质粒的注射液2 mL,对照组注射生理盐水2 mL.于处理后第1、4、7、11、16、21、26、31天空腹采血样制备血清,测定血清中生长激素(GH)、类胰岛素生长因子(IGF-I)、生长激素释放因子(GRF)、生长抑素(SS)的含量.结果表明:试验组在注射pGRF基因质粒后第7天,血清GH含量达峰值,比对照组高了113.47%,差异极显著(P<0.01);然后逐渐下降.到第11天时,比对照组高47.09%,差异显著(P<0.05).到第31天时,与对照组基本一致.试验组血清IGF-I和GRF含量虽然提高幅度不大,但其变化与GH含量存在着显著相关性,均在注射pGRF基因质粒后第7天达到峰值,然后降至对照组水平,其相关系数分别为0.589(P<0.05)和0.678(P<0.05).与对照组相比,试验组血清SS含量在11 d前一直呈下降趋势,第11天时降至最低点,但差异不显著.到第16天时2组均有所上升,21 d后缓慢下降,第31天时与对照组趋于一致.血清SS含量与GH、GRF的含量分别存在显著和极显著负相关,相关系数分别为-0.689(P<0.05)和-0.777(P<0.01).由此可见,pGRF基因质粒在体内快速表达并作用于机体,主要通过提高GRF的含量而促使GH的分泌,同时抑制SS的分泌,一定程度阻止其对GRF和GH的抑制作用,从而达到有效的促生长作用.同时本试验发现,虽然采用了颈静脉导管方法,猪血液中生长轴激素测定值变异仍较大,加强护理和增加测试猪的数量是取得更为客观结果的必要条件.     

影响生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞效果的因素研究

旨在分析生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)转染效果的影响因素,探讨最佳转染条件,为进一步研究生长抑素基因疫苗的作用机制和作用效果奠定基础。以脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞,探讨质粒转染HeLa细胞最佳条件的4个参数:质粒DNA剂量、脂质体剂量、最佳转染时间和质粒提取方法,在荧光显微镜下观察细胞转染情况并计算转染率。结果:在六孔细胞培养板上,当DNA/脂质体剂量为1μg/6μg时,转染效率最高,在转染后72 h达到34.02%;当用Plasmid Maxi Kit试剂盒提取质粒,转染时间为48 h,转染效率最高,达到17.88%。重组质粒pEGS/2SS转染He-La细胞条件是:采用试剂盒(Plasmid Maxi Kit)提取的质粒,DNA和脂质体的剂量分别为1μg与6μg,转染时间48 h,此时的转染效率最高,达17.88%。     

慢病毒介导的生长抑素shRNA对BHK-21细胞生长的影响

采用慢病毒介导的shRNA沉默细胞自身生长抑素（SS）的表达,同时,以pcDNA3．1-SS（pSS）真核表达载体转染细胞作为阳性对照,研究SS对BHK-21细胞的抑制增殖作用,同时观察SS是否具有促进细胞凋亡的作用。MTT法绘制细胞生长曲线可知,pSS转染细胞的生长受到明显抑制,抑制效率为9．63％（P〈0．05）;而LV—sh2组细胞的生长密度是对照组细胞的117．33％（P〈0．05）,表明SS对细胞的增殖具有抑制作用。流式细胞检测细胞凋亡表明,pSS转染组和LV-shRNA感染组凋亡细胞含量分别是对照组凋亡细胞含量的1．97倍（P〈0．05）和24．30％（P〈0．05）,表明SS通过诱导细胞凋亡发挥抑制细胞增殖的作用。本研究为SS及其类似物作为治疗药物的进一步开发应用提供了理论依据。     

N-甲基-D-天冬氨酸对猪生长激素和生长抑素动态分泌模式及特征的影响

本试验通过在日粮中添加一定水平的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)研究其对猪生长激素(GH)和生长抑素(SS)动态分泌模式及特征的影响.选取体重为(53.0±3.6)kg的杜长大三元杂交猪60头,随机分为2组,每组3个重复,每个重复10头猪(公母各1/2,公猪已阉割),分别饲喂添加0、100 mg/kg NMDA的日粮,猪体重接近90 kg时结束试验,分析猪的生长性能并测定GH和SS.结果显示,在日粮中添加100 mg/kg的NMDA,猪的日增重显著增加(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05);GH分泌的总体水平、基线水平和峰强度显著提高(P<0.05).从性别角度而言,阉公猪GH分泌总体水平增加36.91%(P<0.05);基线水平提高了55.69%(P<0.05);母猪GH分泌总体水平提高了45.95%(P<0.05);基线水平提高了50.10%(P<0.05).100 mg/kg NMDA组阉公猪与母猪SS的分泌水平有所提高,但与对照组差异不显著(P>0.05).以上结果表明:日粮添加100 mg/kg的NMDA可以促进猪的生长、提高猪GH的分泌水平,使GH分泌表现出较强的脉冲分泌规律;而NMDA对SS的分泌模式和分泌水平未产生明显影响.     

靶向抑制MAP3K1对小鼠乳腺癌细胞生物学行为的影响

为了在细胞学水平研究靶向抑制MAP3K1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1)基因对小鼠乳腺癌4T1细胞黏附、运动及侵袭能力等生物学行为的影响,试验用体外构建靶向"沉默"MAP3K1基因的amiRNA(artificial microRNA)干扰载体,以X-treme GENE HP转染4T1细胞(干扰组转染amiRNA干扰载体,对照组转染空载体,空白组未转染质粒)对MAP3K1基因mRNA及蛋白表达水平进行检测,以测定干扰效率;分别以黏附试验检测小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附能力,用划痕-愈合试验与Transwell侵袭试验测定小鼠乳腺癌4T1细胞的运动与侵袭能力。结果表明:小鼠乳腺癌4T1细胞转染MAP3K1 amiRNA-3干扰载体与空载体后,干扰4T1细胞MAP3K1 mRNA水平及蛋白水平均被有效抑制,干扰效率高达70%(P0.01)。试验组4T1细胞黏附能力极显著低于对照组(P0.01);干扰组4T1细胞的运动与侵袭能力均显著低于对照组(P0.05)。说明构建的amiRNA干扰载体能够有效抑制靶基因MAP3K1的表达,并能够显著抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附、运动与侵袭能力;靶向抑制MAP3K1基因能够广泛地影响小鼠乳腺癌4T1细胞的生物学行为。     

水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选

试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。     

猪SMYD3基因的克隆、序列分析及其对猪成纤维细胞增殖的影响

试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P<0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P<0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。     

慢病毒介导的水牛CD14基因shRNA序列的筛选

研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。     

鹅生长过程中血清生长抑素水平变化的研究

本文研究了四季鹅在生长过程中,外周血液生长抑素(Somatostatin,SS)水平的变化,同时观察了甲状腺激素T_3、T_4和血清脲氮(BUN)水平以及与其增重型的关系。同日孵出的四季鹅分批于2、16、30、44、58、72日龄时称重、采血,用放射免疫法测定血清SS、T_3、T_4水平。结果表明,鹅孵出后,相对增重越高、SS水平则越低,SS与生长速度之间存在着显著负相关(r=-0.82,P<0.05),与T_3变化呈强负相关(r=-0.73,P<0.05),与BUN呈正相关(r=0.91,P<0.01)。提示在鹅生长过程中,SS水平降低时,T_3水平升高,组织中氮沉积增加,使增重速度加快。     

Cloning of Pig ZO-1 Gene and Screening on its Effective shRNA Fragments

The aim of this study was to screen effective shRNA fragments targeting pig zonula occludens-1 (ZO-1) gene,which would lay foundation to further explore its function in pig oocytes in vitro maturation (IVM) by RNAi technology.Pig ZO-1 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed,its effective shRNA fragments were screened.The results showed that the CDS length of cloned pig ZO-1 gene was 3 036 bp.The results of sequence multialigned showed that the sequence of pig ZO-1 gene shared 88%,88%,87% and 85% homology with Taurus,Ovis aries, Equns caballus and Homo sapiens,respectively.Clear RFP red fluorescent was observed in transfected cells with the pDsRed-N1-ZO-1 eukaryotic expression plasmid transfected into HEK293T cells by X-tremeGENE HP DNA transfection reagent.Two shRNA fragments targeting pig ZO-1 gene were designed and synthesized,weaker RFP red fluorescent was observed in co-transfected cells with the target and interfered shRNA plasmid groups.The Real-time PCR results showed that the two designed shRNAs could effectively inhibit the expression of pig ZO-1 mRNA,shRNA201 fragment had significantly higher inhibition effect than that of shRNA1276 fragment (77.8% and 67.0%,P < 0.05).     

猪紧密连接蛋白1基因克隆及其shRNA片段的筛选

试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1 (zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036 bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48 h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1 shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1 shRNA1276 (77.8%和67.0%,P < 0.05)。     

渗透胁迫下不同地理种源白刺的生理响应

以武威、张掖、酒泉3个地理种源的唐古特白刺为研究对象,测定不同浓度PEG胁迫下白刺的相对含水量、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白及抗氧化酶等各生理指标的变化。结果表明,PEG渗透胁迫造成3个种源白刺相对含水量下降,丙二醛积累,同时超氧化物歧化酶活性上升,过氧化氢酶活性先升后降及脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量增加,除了3个种源的超氧化物歧化酶活性与对照差异不显著外(P>0.05),其余指标与对照均差异显著(P<0.05)。从相关分析结果看出,3个种源白刺丙二醛与超氧化物歧化酶、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白均呈极显著相关,相对含水量与超氧化物歧化酶、可溶性蛋白、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖均呈极显著负相关,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶之间呈极显著或显著相关;主成分分析看出,白刺的第1主成分为相对含水量、膜脂过氧化产物丙二醛和渗透调节物质, 第2主成分为超氧化物歧化酶,第3主成分为过氧化氢酶。在PEG胁迫下,3个地理种源白刺的耐旱性表现为酒泉种源>张掖种源>武威种源。     

罗非鱼无乳链球菌EsxA基因克隆与原核表达

Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。     

猪链球菌2型分泌核酸酶(SsnA)的表达、ELISA方法建立及其在鉴别诊断中的应用

猪链球菌2型(Streptococcussuis type 2,SS2)是一种广泛分布的人畜共患病原菌,严重危害着人类健康和养猪业的发展。本试验旨在研究分泌核酸酶基因(SsnA)作为分子诊断标识在对SS2感染的鉴别诊断中所起的作用。作者以SS2-LT菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增SsnA基因片段,将该片段克隆到表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为46 ku的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白质具有抗原反应活性。以纯化的融合蛋白作为包被抗原,建立了SsnA-ELISA鉴别诊断方法。对已知背景的人工感染及疫苗免疫血清和临床血清进行检测,比较感染血清和免疫血清的检测结果,结果发现两者差异显著(P<0.05),表明建立的SsnA-ELISA方法具有良好的检测效果。利用该方法对采集自8个省份的1 446份血清进行检测,显示SS2的阳性率为0%~14.77%,平均阳性率为5.39%。本研究结果表明:猪链球菌2型SsnA可以作为一个良好的鉴别感染的分子诊断标识;对临床血清的检测结果表明感染及流行与气候环境存在明显的关系。     

First insights into the protective effects of a recombinant swinepox virus expressing truncated MRP of Streptococcus suis type 2 in mice

To explore the potential of the swinepox virus (SPV) as vector for Streptococcus suis vaccines, a vector system was developed for the construction of a recombinant SPV carrying bacterial genes. Using this system, a recombinant virus expressing truncated muramidase-released protein (MRP) of S. suis type 2 (SS2), designated rSPV-MRP, was produced and identified by PCR, western blotting and immunofluorescence assays. The rSPV-MRP was found to be only slightly attenuated in PK-15 cells, when compared with the wild-type virus. After immunization intramuscularly with rSPV-MRP, SS2 inactive vaccine (positive control), wild-type SPV (negative control) and PBS (blank control) respectively, all CD1 mice were challenged with a lethal dose or a sublethal dose of SS2 highly virulent strain ZY05719. While SS2 inactive vaccine protected all mice, immunization with rSPV-MRP resulted in 60% survival and protected mice against a lethal dose of the highly virulent SS2 strain, compared with the negative control (P < 0.05). Our data indicate that animals immunized with rSPV-MRP had a significantly reduced bacterial burden in all organs examined, compared to negative controls and blank controls (P <0.05). Antibody titers of the rSPV-MRP-vaccinated group were significantly higher (P <0.001), when compared to negative controls and blank controls. Antibody titers were also significantly higher in the vaccinated group at all time points post-vaccination (P <0.001), compared with the positive controls. These initial results demonstrated that the rSPV-MRP provided mice with protection from systemic SS2 infection. If SPV recombinants have the potential as S. suis vaccines for the use in pigs has to be evaluated in further studies.