用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得

用水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）的幼胚、愈伤组织作受体,采用ＰＩＧ基因枪法,成功地将苏云金杆菌毒蛋白基因〖Ｂｔ毒蛋白基因,ｃｒｙＩＡ（ｂ）〗和马铃薯蛋白酶抑制剂基因（ｐｉｎⅡ基因）连同抗除草剂Ｂａｒ基因分别转入不同的水稻中,获得大量的转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交分析途中外源抗虫基因均分别整合到水稻的基因组中。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显示它们在水稻叶片中表达的水平较高。外源基因在一代中遵循３     

转Bt-cry1Ab玉米花粉对意大利蜜蜂生长发育及体内酶活性的影响

自10年前首次种植转基因植物以来,转基因作物已在全球得到大面积推广。这些转基因作物中绝大多数品种具有抗虫基因能够增强作物对靶标昆虫的抗性。同时转抗虫基因植物可能带来的生态安全和环境问题也引起了国际社会广泛的关注。鉴于此,本实验开展了转Bt-cry1Ab基因抗虫玉米花粉     

农杆菌介导法获得大量转双价抗虫基因水稻植株

构建含Bt杀虫基因cryIA(c)和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI的双价抗虫转基因载体PCAM-Bt-CpTI，并用于农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导法对粳稻品系“浙大19”遗传转化，约2000块盾片愈伤组织与农杆菌共培养后，得到了约1300块潮霉素抗性愈伤，从中分化抗性再生苗约1500株，对不同抗性愈伤来源的70个T0代再生株进行PCR及PCR-Southern检测，62株为转cryLA(c)和CpTI双价抗虫基因植株，阳性植株比例为88.6%，抗虫鉴定表明，3个转基因T1代株系对二化螟有很高的毒性。     

Bt毒蛋白抗虫植物基因工程研究（综述）

本文简要回顾了苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因在抗虫植物基因工程研究中的进展情况。包括Ｂｔ基因分类,Ｂｔ基因的结构和特性,Ｂｔ毒蛋白的杀虫机理,昆虫对Ｂｔ产生抗性的机制以及抗虫转基因植物的研究,并对其农业生产上的应用进行了展望。     

西红柿原系统素基因转化水稻的抗虫性研究

构建了两个含西红柿原系统素基因的双元载体pNAR304（UbiI5’+Prosystemin+NOS3’）和pNAR305 (UbiI5’+Prosystemin+NOS3’+ PinⅡ5’+PinⅡ+PinⅡ3’)，并用农杆菌介导方法将其转入水稻品种秀水63、合江19和日本晴。经潮霉素抗性、PCR和Southern blot确证，共获得转基因水稻14株。Northern blot检测表明，原系统素基因(Prosystemin)和马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)在这些转基因植株中都能转录表达。然而，植株的二化螟和褐飞虱抗虫性鉴定表明：单独转入Prosystemin（pNAR304）不能提高转基因水稻的抗虫能力；Prosystemin和PinⅡ双价（pNAR305）转基因植株能明显提高水稻的抗虫性，但其抗性水平与PinⅡ单个基因的转基因水稻植株间并无显著差异。 这表明，Prosystemin基因转入水稻并不能有效调节转基因水稻PinII基因的表达量。据此试验结果推测，水稻中可能不存在类似于西红柿系统素的信号途径，很可能水稻的伤害信号转导是经由与双子叶植物系统素体系不同的其它途径来实现的。     

Collimonas sp.ZL261蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学特性

分离自西藏色季拉山海拔4530 m高山草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas sp.)ZL261代谢产物具有很高的蛋白酶活性,为了明确其蛋白酶种类及其作用特点,本文采用限制性内切酶法构建了菌株ZL261的基因组文库,利用透明圈法筛选其胞外蛋白酶活性克隆,对其基因及蛋白结构进行了分析,进一步研究了该酶的表达和酶学特性。结果表明:该蛋白酶基因(命名为capro)包含一个长为1092 bp的完整开放阅读框(GenBank:KF992845),其编码蛋白由363个氨基酸组成;序列比对和同源性分析结果显示,该氨基酸序列与食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)Ter331胞外蛋白酶序列(NC015856)相似性最高,为83%;一级、二级和三级结构分析均显示该蛋白含M35金属蛋白酶家族(EC 3.4.24.20)保守结构域。蛋白酶基因在大肠杆菌DH5α中异源表达获得了约38 kDa的目的蛋白。ZL261粗酶液对金属蛋白酶抑制剂EDTA敏感,最适作用pH值为7,最适温度30℃,在10℃时仍保持70%以上酶活力。综合分析可知,该蛋白酶为中性低温金属蛋白酶。具有较好的开发应用潜能。研究结果为微生物蛋白酶的开发提供了新型种质资源,也为探求不同生境微生物蛋白酶的系统进化关系提供了基础信息。     

植物诱导抗虫基因研究进展

植物的诱导抗虫基因可分为3类，即防御基因、防御物质合成基因和信号途径基因，综述了这3类基因的种类及其功能。植物诱导抗虫基因除了受昆虫和损伤诱导外，还受植物激素茉莉酮酸酯、水杨酸、阿司匹林、脱落酸和乙烯，以及其它信号物质的调控，这些信号物质的调控途径组成了复杂的植物防御的信号传输网络。植物诱导抗虫基因的研究将为害虫防治提供新的途径。     

转单价及双价基因抗虫棉田棉铃虫发生动态初报

试验研究转单价及双价基因抗虫棉田棉铃虫的发生动态结果表明,转单价及双价基因抗虫棉的棉叶、蕾、铃被害率均显著低于常规棉,抗虫棉田第2代、3代棉铃虫幼虫发生数量均很少,第4代虽有一定数量发生但低于常规棉棉田。第2代、3代和4代棉铃虫发生期间,转单价及双价基因抗虫棉田其幼虫平均数量及棉叶、蕾、铃被害率均未达显著差异水平,表明在田间转单价与双价基因抗虫棉对棉铃虫的抗性差异不明显。     

人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

作物转Bt抗虫基因育种研究进展

本文概述了Bt抗虫基因的特性及其人工合成和转导技术 ,并根据转Bt基因作物种质的特点和遗传缺陷 ,总结了进行转Bt基因作物育种改良的策略 ,介绍了国内外转Bt基因植株鉴定、筛选技术和育出的优良品系及商业化生产状况 ,讨论了Bt抗虫基因在育种应用中存在的问题及其解决途径     

易变山羊草中抗虫相关基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

易变山羊草是小麦近缘种植物，对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、根结线虫(Meloidogyne naasi)都具有很高的抗性。本实验根据小麦另一近缘种植物节节麦的抗虫基因Cre3保守区核苷酸序列设计合成正向引物，通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)从易变山羊草的RNA中扩增出抗虫相关基因部分cDNA片段。     

转基因抗虫棉对棉花纤维品质的影响

以一组不同抗虫类型的陆地棉(Gossypium hirsutum L．)抗虫品种和一组常规棉(G．hirsutum L．)品种作为亲本，按照不完全双列杂交(NCⅡ)试验设计配制杂交组合，将亲本材料和F。代杂交种子按照随机区组设计方法，同时在网室和试验田进行棉花抗红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)鉴定和棉花抗虫性对棉花纤维品质的影响试验。结果表明，具有外源抗虫基因的抗虫棉材料对红铃虫具有很强的抗性，抗虫棉的纤维品质较好，大多数抗虫棉品种达到了育种目标要求。相关分析结果表明，棉花种子虫害率与马克隆值成显著负相关；与衣指成显著正相关；与2．5％跨距长度、整齐度、比强度、伸长率和子指等指标相关性较低。利用外源抗虫基因转化的棉花新品种，用其作为亲本采用杂交育种法可以培育出优质的抗虫棉花新品种，而且提高棉花品种的抗虫性并不影响棉花纤维品质。     

华北地区转Cry1A+CpTI和Cry1A基因棉棉田害虫和天敌昆虫的群落结构*

2000～2001年采用背负式机动吸虫器取样法研究了转抗虫基因棉,双价(Cry1A十CpTI)转基因棉(SGK321)和Bt(Cry1A)棉(GK12),棉田的害虫和天敌群落结构。结果表明,从害虫群落组成上看,转抗虫基因棉田平均查得15科19种,从普通棉不施药和施药对照田平均分别查得14科17．5种和13．5科17．5种;转抗虫基因棉田的主要种类数量多于普通棉不施药和施药对照田,普通棉施药田主要优势种类为烟粉虱(Bemisia tabaci)和棉蚜(Aphis gossypii)2种;转抗虫基因棉田的绿盲蝽(Lygus lucorum)高于普通棉不施药和施药对照田,棉铃虫(Helicovcrpa armigera)是普通棉不施药对照田的常见种,转抗虫基因棉田则无。从天敌群落组成上来看,从转抗虫基因棉田共查得平均24．3科39.3种,从普通棉不施药和施药对照田平均分别查得24科43．5种和25科38种;微小花蝽、姬小蜂(Chrysonotomyia)和异须盲蝽(Cumpylomms diversicornis)为转基因棉和普通棉不施药对照的优势种,蜘蛛(Araneida)的优势度有所上升并成为丰盛种;而在普通棉施药处理田中,棉短瘤蚜茧蜂(Trioxys rietscheli)和龟纹瓢虫(Propylaea japonica)为优势种,寄生蚜虫跳小蜂(Aphidencyrtus shikokians)、棉短瘤蚜茧蜂(Trioxys rietschcli)和黄足蚜小蜂(Aphelinus flavipes)数量有所上升,成为丰盛种。相比而言,转抗虫基因棉田害虫和天敌的主要种类数量都明显多于普通棉施药田,表明转抗虫基因棉有利于保护棉田的生物多样性和棉田生态系统的管理。     

福建省转基因抗虫稻田节肢动物群落多样性研究

试验研究转MH86^CpTI基因抗虫水稻和转MH86^CpTI＋Bt双价基因抗虫水稻稻田节肢动物群落的多样性，结果表明：转基因稻田节肢动物群落可分为先锋群落、郁闭未稳定群落和郁闭稳定群落3个阶段；在水稻灌浆期到蜡熟期，转基因水稻稽田中每次采得的节肢动物的物种数为CK〉MH86^CpTI〉MH86^CpTI＋Bt，个体数量大小为CK〉MH86^CpTI〉MH86^CpTI＋Bt，总体多样性指数与均匀性指数均为CK〉MH86^CpTI〉MH86^CpT＋Bt；转基因水稻稻田节肢动物群落的多样性与常规稻相比未见明显差异。在水稻生育前期与后期，转基因抗虫水稻田害虫优势度最高的分别为电光叶蝉和褐飞虱。     

家蚕消化液35K蛋白酶基因的克隆及序列同源性分析

根据纯化的家蚕35K蛋白酶N末端氨基酸序列设计简并引物，从家蚕中肠组织cDNA库中分离并克隆该蛋白酶基因,对由DNA推测的氨基酸序列进行同源性检索。结果表明：存在于家蚕消化液中的35K蛋白酶基因长939bp，可编码313残基的多肽链，其中信息肽为22aa，活性肽为22aa，成熟的蛋白酶由269aa组成。与其他昆虫消化液的类胰凝乳蛋白酶具有同源性，是存在于家蚕消化液中的一种新发现的蛋白酶。     

陆地棉巯基蛋白酶抑制剂基因克隆及其氨基酸序列分析

通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。     

GNA基因在小麦中的表达与抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin), gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202，通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗， 将外源gna基因导入到3个高产小麦(Triticum aestivum L.)品种中，获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证，确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明，小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集，并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphum padi )试验，蚜口密度抑制率从19%～73%不等，部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中，并可有效地增强小麦的抗蚜能力，为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

不同发育时期转基因高粱不同株系Cry1Ab蛋白含量的比较

高粱的害虫种类众多,影响着产量与品质,培育抗虫品种是重要的育种目标,但目前高粱中缺乏有效的抗螟虫资源,难以通过常规育种培育出抗螟虫的品种。张明洲(2002)成功地将来自Bt密码子优化的抗虫基因cry1Ab转入高粱中,并经农业部批准进入中间试验阶段。为有效和合理地利用这一抗虫     

我国转Bt抗虫基因棉杀虫活性的时间与空间动态分析

利用我国研制的转Ｂｔ抗虫基因棉ＧＫ－１２品系,系统测定了对棉铃虫杀虫活性的时间与空间动态。结果表明,转Ｂｔ抗虫基因棉相同部位叶片的杀虫活性随着棉花的生育期呈下降的趋势,并在盛花期之后显著降低;各花器的杀虫活性在田间棉铃虫第三代期明显高于第四代期;在模拟棉铃虫田间自然取食的条件下,第四代期的幼虫世代存活率明显高于二代期,有０．４％的幼虫可以发育至蛹期。转Ｂｔ抗虫基因棉不同器官杀虫活性的顺序为：叶〉蕾     

不同发育时期转基因高梁不同株系Cry1Ab蛋白含量的比较

高粱的害虫种类众多，影响着产量与品质，培育抗虫品种是重要的育种目标，但目前高粱中缺乏有效的抗螟虫资源，难以通过常规育种培育出抗螟虫的品种。张明洲（2002）成功地将来自Bt密码子优化的抗虫基因crylAb转入高粱中，并经农业部批准进入中间试验阶段。为有效和合理地利用这一抗虫资源，有必要了解crylAb基因的表达情况，本实验分析了田间自然条件下crylAb基因在不同发育时期的表达水平，并对不同转基因高粱株系的CrylAb蛋白含量进行了比较。