甘蓝型油菜PIN家族基因的鉴定与生物信息学分析

PIN家族基因是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件, PIN基因编码生长素输出蛋白, 介导生长素在植物体的运输, 然而在基因组较复杂的甘蓝型油菜中缺乏系统研究。本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜全基因组数据库筛选甘蓝型油菜PIN家族基因, 对鉴定出的29个BnPINs基因开展拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、PIN蛋白二级结构及三级结构预测等研究, 结合高通量转录组测序进行低氮胁迫下的转录水平分析。结果表明, 甘蓝型油菜PIN家族基因拷贝数明显多于拟南芥、甘蓝和白菜所具有的PIN家族基因数量; BnPINs蛋白多属于由碱性氨基酸组成的稳定蛋白, 含有保守的N末端结构域, 二级结构与拟南芥PIN蛋白相似; 系统进化选择能力分析表明, BnPINs基因与甘蓝和白菜PIN家族基因进化关系相近。转录组测序表明, BnPIN1s、BnPIN2s、BnPIN3s基因主要在甘蓝型油菜根部表达且受长期低氮(72 h)诱导, BnPIN6s和BnPIN8s基因主要在地上部表达, 低氮会抑制BnPIN6s表达。本研究结果为进一步研究甘蓝型油菜PIN家族基因生物学功能尤其是在响应低氮胁迫中的功能奠定基础, 为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。     

甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因的鉴定及功能性研究

液泡是调控植物细胞分化、生长发育的重要部位,AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因调控植物液泡内外离子平衡、离子运输以及能量供应。本研究利用功能已知的拟南芥AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因为参考序列在甘蓝型油菜全基因组数据库、NCBI植物基因组注释数据库等鉴定并筛选出9个BnaAVP1、3个BnaVHA-a2和4个BnaVHA-a3,并分析基因拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、蛋白二级结构及三维结构预测、高通量转录组测序等。发现甘蓝型油菜BnaAVP1和BnaVHA-a3的基因数量明显多于甘蓝和白菜;甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白属于由酸性氨基酸组成的稳定蛋白;系统进化选择能力的分析表明,甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3家族基因与甘蓝、白菜关系相近。转录组测序表明,低氮处理后,BnaAVP1s基因主要在地上部表达,且低氮3h后地上部表达下调,低氮处理72h根中表达量上调;BnaVHA-a2s和BnaVHA-a3s基因在地上部和根中均有表达,BnaVHA-a2s在低氮处理72h后表达量基本呈上调趋势,BnaVHA-a3s在低氮3h后基本呈下调趋势。低磷处理后,BnaAVP1s根中大部分基因表达上调,地上部表达基本无差异;BnaVHA-a2s表达基本无差异;BnaVHA-a3s地上部和根中均基本为上调趋势。该结果为进一步研究甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因生物学功能及AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白水解ATP提供能量供植物代谢的分子机制奠定基础,为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。     

甘蓝型油菜响应低氮胁迫的表达谱分析

随着人们对作物产量的需求不断提高,氮肥被过量施用,而作物的氮素利用率(NUE)却在不断降低。本研究从低氮胁迫下油菜的生理变化入手,结合高通量的数字基因表达谱测序技术,分析了油菜在低氮0、3、72h下的转录组差异响应,鉴定了氮的吸收﹑转运﹑分配和转录因子等方面的差异表达基因。结果表明,甘蓝型油菜在低氮处理后,氮优先分配到地上部,硝酸还原酶(NR)活性显著降低,而谷氨酞胺合成酶(GS)活性升高,油菜植株总氮浓度降低, NUE升高。基因基因本位论(GO)功能与京都基因和基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析表明,地上部差异表达基因主要是参与代谢过程、蛋白结合、离子结合、阴离子结合等,根中差异表达基因主要是参与分子功能、初级代谢过程、离子结合、阴离子结合等。基因表达谱分析表明,低氮胁迫72 h后,根中BnaGLNs家族基因表达大部分升高;根中BnaWRKY33s和BnaWRKY70s的基因表达量降低;BnaMYB4s、BnaMYB44s和BnaMYB51s亚家族中的大部分基因的表达量降低;BnaNIAs家族中的大部分基因表达上调;在BnaNRT2.1s和BnaNRT3.1s亚家族中,根中BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04560D)、BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04570D)、BnaA2NRT3.1 (BnaA02g11760D)、BnaC2NRT3.1(BnaC02g16150D)的表达上调。同时,地上部和根发生外显子跳跃(SE),外显子选择性跳跃(MXE)类型的可变剪接积极加强对低氮的适应。总而言之,在低氮处理下,甘蓝型油菜可以通过调控BnaNRTs、BnaGLNs、BnaNIAs家族基因提高NUE,以及调控BnaMYBs、BnaWRKYs家族和可变剪接积极适应低氮胁迫。     

甘蓝型油菜铵转运蛋白基因家族成员的鉴定与表达分析

了解异源四倍体甘蓝型油菜中AMT基因家族的功能,为进一步克隆和利用基因改良甘蓝型油菜的氮素利用效率和铵毒抗性提供一定的理论基础。利用生物信息学的方法鉴定出20个BnaAMTs基因,其中14个为AMT1亚家族成员,6个为AMT2亚家族成员,它们不均匀地分布在油菜的12条染色体上。进化与保守基序分析结果表明,BnaAMTs蛋白亚家族内的蛋白质序列保守性较高,但亚家族之间的差异较大。BnaAMTs基因在油菜不同组织中的表达谱显示,该基因家族表达具有组织特异性。利用转录组测序结果分析发现,根部在供应高浓度的铵态氮和硝态氮时,BnaA7.AMT1;3表达量最高;在硝态氮缺乏条件下,BnaA5.AMT1;1表达量最高;在上述几种处理下,BnaC6.AMT1;1都是地上部表达量最高的拷贝。在缺硼或缺磷条件下,油菜BnaAMTs基因整体呈现表达上升的趋势;但在盐胁迫条件下,表达量下降;镉胁迫对BnaAMTs基因的表达影响较小。这些基因可能在铵态氮与其他必需营养元素的互作、镉胁迫、盐胁迫等逆境响应中发挥一定的作用;并为进一步深入解析甘蓝型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基础。     

草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT1/PTR FAMILY 5.8基因的克隆及生物信息学分析

硝态氮是植物主要的氮素营养来源,与植物的生长发育与抗性能力密切相关。硝态氮的吸收与运转对提高植物氮素利用效率有调控作用,其中硝酸盐转运蛋白发挥重要作用。本研究通过RT-PCR的方法克隆得到草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT1/PTR FAMILY 5.8基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。结果表明,该基因编码区长度为1 434 bp,共编码477个氨基酸。NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白分子量为51.7 kD,等电点为4.9。NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白共有8个跨膜结构域,3个糖基化,位点无信号肽,预测定位于质膜或内质网中。NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白含有结构域PTR2属于MFS蛋白超家族。草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 5.8蛋白与二穗短柄草,粗山羊草的相似度较高,而且不同物种之间的NRT1/PTR FAMILY 5.8与NRT1/PTR FAMILY 5.9的同源进化关系较近。本研究为进一步研究NRT1/PTR FAMILY 5.8基因的功能及硝酸盐转运途径具有重要意义。     

甘蓝型油菜海藻糖磷酸合成酶(TPS)基因家族的生物信息学分析

海藻糖磷酸合成酶(TPS)在植物响应多种非生物胁迫及生物胁迫时起着重要的作用,但目前对甘蓝型油菜中TPS基因的了解甚少。本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜基因组中筛选甘蓝型油菜TPS家族基因,对鉴定出的31个BnTPSs基因进行分子特征、蛋白特性、蛋白结构域、保守基序、顺式作用元件、KaKs、染色体定位、系统进化树构建等研究。系统发育分析表明,BnTPS家族分为Ⅰ和Ⅱ类,家族成员数明显比甘蓝、白菜和拟南芥中的TPS基因数多,不规则分布于染色体上。多数蛋白呈酸性,分别在N端和C端具有TPS和TPP结构域。顺式作用元件分析表明,TPS家族与植株抗逆境胁迫有关。KaKs分析表明,大多BnTPSs家族成员有多拷贝基因,基因在纯化选择压力下进化。本研究结果为进一步研究甘蓝型油菜TPS家族基因生物学功能尤其在响应逆境中的功能奠定理论基础。     

甘蓝型油菜BES1转录因子家族的鉴定及比较基因组学分析

BES1转录因子家族对调节植物的生长发育和逆境胁迫具有非常重要的作用。本研究在甘蓝型油菜基因组测序完成的基础上,对芸薹属作物BES1转录因子家族的进化及表达进行了系统深入研究。本研究在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝和拟南芥全基因组中分别鉴定到29条、15条、14条和8条BES1转录因子。通过系统发育、基因结构和保守基序的分析,这些转录因子被分为三组,即Group A、Group B和Group C。在甘蓝型油菜与白菜、甘蓝和拟南芥间分别鉴定出30对、32对和23对直系同源基因。甘蓝型油菜中含有15对旁系同源BES1基因,显著的高于其它3个物种。大多数BES1基因在根和叶中都具有较高的表达水平,表明这些基因在甘蓝型油菜生长发育过程中起到重要的作用。本研究对进一步探索该家族调控植物的生长及逆境适应的分子机制奠定了基础,同时为其它基因家族的研究提供了指导。     

草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT2.4基因序列的克隆及表达分析

植物硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter,NRT)可有效调节与转运NO3-,提升氮素利用效率.分析草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT2.4基因在不同氮素浓度下的表达规律,旨在揭示硝酸盐转运蛋白NRT2.4基因在氮素调控中扮演的角色.以草地早熟禾为材料,首先设计特异引物,利用RT-PCR技术克隆得到草地早熟...     

芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea)TCP基因家族全基因组鉴定和分析

TCP蛋白是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物叶发育、花对称性、侧枝发育等过程,具有重要的调控作用。为了揭示芸薹属TCP基因家族的功能和进化关系,本研究利用生物信息学方法对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的TCP转录因子家族成员、基因分类、基因结构、系统进化关系和结构域序列保守性进行分析。研究表明,白菜和甘蓝的TCP基因成员各有37条、甘蓝型油菜TCP基因成员有78条,且全部为亲水蛋白,大部分的TCP基因结构简单,不含内含子;序列分析表明,这些TCP基因均具有高度保守的TCP结构域;根据结构域差异和系统发育分析的结果,将白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TCP基因分为两类:ClassⅠ和ClassⅡ,ClassⅡ可继续分为CIN和CYC/TB1两个小组;聚类分析发现,芸薹属中白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TCP基因与拟南芥垂直同源的At TCP11、At TCP16、At TCP23的TCP基因缺失,可能与芸薹属发生三倍化事件或驯化过程中的人工选择有关。以上研究将为揭示芸薹属TCP基因的功能提供重要的理论基础。     

甘蓝型油菜脯氨酸合成相关同源基因的进化和差异表达分析

以异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus)及其二倍体祖先白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)为对象,研究了脯氨酸合成途径关键酶基因P5CS和OAT的进化命运以及各自不同祖先来源的同源基因的差异表达情况。序列比对和进化分析表明,甘蓝型油菜中P5CS基因和OAT基因和其二倍体祖先的相对应基因高度同源;进化上,和二倍体亲本相比甘蓝型油菜P5CS2基因发生了1个拷贝的丢失,而OAT基因没有基因丢失现象;半定量RT-PCR结果表明,甘蓝型油菜中来自二倍体亲本白菜和甘蓝的P5CS2和OAT同源基因在所有检测器官中均表达,没有发生基因沉默;但是它们可能发生了亚功能化,不同祖先来源的2个P5CS2同源基因存在较弱的偏向性表达,不同器官的同源基因表达模式稍有不同;而OAT基因明显偏向于表达来自于甘蓝祖先的同源基因,OAT的2个同源基因的不同器官表达模式基本一致;盐胁迫处理后,来自于甘蓝的BnaC.P5CS1.d表达量显著高于来自于白菜的Bna A.P5CS1.a,表明盐处理条件下甘蓝型油菜偏向性表达BnaC.P5CS1.d。甘蓝型油菜的脯氨酸合成基因Bna A.P5CS1.a、BnaC.P5CS1.d及Bna A.P5CS2.a、BnaC.P5CS2.c的盐诱导表达模式均基本保持了亲本来源基因的特征。以上结果表明,与二倍体祖先相比,甘蓝型油菜中脯氨酸合成基因序列和表达模式均存在高度保守性,这可能说明了脯氨酸积累在进化上对植物的有利性。     

利用异源六倍体(A~rA~rA~nA~nC~nC~n)与甘蓝种间杂交合成甘蓝型油菜的新方法

利用亲本种的遗传变异是改良油菜的重要途径,本研究提出一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的新方法。以甘蓝型油菜(AnAnCnCn)品种中双11号为母本,与白菜型油菜(ArAr)品系SWU07杂交,经染色体加倍获得异源六倍体(ArArAnAnCnCn),再与甘蓝(CoCo)杂交,创建出具有亲本种遗传成分的新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo)。该六倍体连续3个世代核型稳定,各世代中的自交和自由授粉结实率无显著差异,花粉育性在94.6%～98.8%之间,3个世代自交平均结实率为每角果5.47粒,自由授粉平均结实率为每角果7.93粒;各世代六倍体(ArArAnAnCnCn)与不同类型甘蓝杂交平均结实率分别为每角果0.05、0.04、0.05粒,世代间无显著差异,且六倍体与栽培、野生甘蓝杂交结实性无显著差异,可交配性不受六倍体世代及甘蓝类型的影响。尽管该六倍体与甘蓝可交配性较低,但仍可在田间条件下成功杂交,获得新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo),表明以ArArAnAnCnCn六倍体为桥梁与甘蓝杂交,是一种有效导入甘蓝遗传成分、创建新型甘蓝型油菜的新方法。     

甘蓝型油菜开花相关基因的鉴定及进化与表达分析

开花是开花植物繁衍后代的前提,控制开花时间对农作物获得高产稳产具有重要影响。然而,关于甘蓝型油菜基因组水平上开花相关基因的信息报道较少。本研究对甘蓝型油菜开花相关的基因进行了鉴定、特征分析、进化与表达模式分析。结果表明,基因组水平上共鉴定到甘蓝型油菜1173个开花相关基因,这些基因分为9类,且不均匀地分布在染色体上;与白菜(AA,2n=20)和甘蓝(CC,2n=18)相比,甘蓝型油菜(AACC,2n=38)经过自然杂交和染色体加倍后,使开花相关基因的数目显著扩增;选择压力分析表明,糖代谢信号途径的基因比自发途径的开花相关基因受到的选择压力更大;仍有一些开花相关基因在拟南芥和油菜基因组内非常保守。甘蓝型油菜基因数目的扩增和功能分化导致其开花调控机制更加复杂,本研究为油菜开花途径提供更多的信息,也为阐明拟南芥和油菜开花基因的进化关系指明了方向。     

DEP1与NRT1.1B基因的遗传互作对水稻氮素利用的影响

提高氮素利用效率一直是水稻遗传改良攻关的重点方向。直立穗等位基因dep1及籼稻等位基因nrt1.1b均有利于提高水稻氮素利用效率,因此,阐明DEP1与NRT1.1B基因的互作关系对水稻氮素利用的影响对培育氮高效水稻品种具有重要指导意义。以携带不同DEP1与NRT1.1B基因型组合的重组自交系为供试材料,在低、中及高氮条件下（分别记为LN、MN和HN）,分析了DEP1与NRT1.1B基因间不同的遗传互作方式对水稻氮素利用、产量及其构成因素的影响。结果表明,不同氮素条件下,基因型组合dep1/nrt1.1b具有最大的氮素收获指数;LN条件下,nrt1.1b基因有利于提高氮素利用效率,在MN和HN条件下dep1基因有利于提高氮素利用效率;携带dep1基因株系有效穗数和穗粒数显著提升,其产量均值显著高于其他株系,而NRT1.1B基因对产量无显著影响。     

人工合成甘蓝型油菜抗旱性及DNA甲基化水平分析

甘蓝型油菜是具有重要经济价值的多倍体物种,是优质食用植物油和饲料蛋白质的重要来源之一。但是其驯化历史较短,遗传背景狭窄,且在整个生命周期中都对干旱胁迫敏感,因此培育高产耐旱品种是甘蓝型油菜的重要育种目标之一。本文用15%PEG-6000模拟干旱胁迫,对人工合成甘蓝型油菜不同世代(S1～S4)及其二倍体亲本进行不同时间的胁迫处理,并结合表型观察,以及叶片中丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等生理指标的测定,初步了解上述材料的抗旱性差异。结合表型观察和叶片中相对含水量分析,发现人工合成甘蓝型油菜S1～S4及其亲本的抗旱性表现为甘蓝 Bn-S3 Bn-S4 Bn-S1 Bn-S2白菜型油菜。干旱胁迫后Bn-S3、Bn-S4的POD及SOD活性较高,MDA含量较低,表明Bn-S3和Bn-S4能更加有效地清除活性氧(ROS),对过氧化损伤的防御能力更强。通过HPLC分析发现所有材料的甲基化水平在胁迫12 h时最高,其中亲本白菜型油菜Br的甲基化水平最高, Bn-S1和Bn-S4介于两亲本之间,而Bn-S2和Bn-S3低于两亲本。甲基化敏感多态性分析也显示人工合成甘蓝型油菜在干旱胁迫后,甲基化和去甲基化水平均发生了明显的变化,表明植物的甲基化变化可能有利于提高其抗旱能力。     

甘蓝型油菜光敏色素互作因子4(BnaPIF4)基因克隆和功能分析

光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4, PIF4)是光信号途径关键转录因子, PIF4与BZR互作介导光信号与油菜素内酯信号互作,参与植物光响应。本文在甘蓝型油菜湘油15号中克隆到2个PIF4基因,分别定位于A03号染色体和C03号染色体,命名为BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03,全长编码序列(coding sequence, CDS)、全长mRNA和全长基因分别为1242 bp和1245 bp、1701 bp和1731 bp、2527 bp和2665 bp,各自编码413和414个氨基酸。BnaPIF4_A03具有7个外显子和6个内含子, BnaPIF4_C03具有8个外显子和7个内含子,与测序品种中双11号相比, BnaPIF4_A03基因第1内含子存在单碱基插入突变,第4和第6内含子存在缺失突变,且具有更长的3'-UTR,两基因其他序列在湘油15号和中双11号之间无差别。BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因编码蛋白具有典型的植物bHLH结构域,亚细胞定位于细胞核,是典型的植物PIF4蛋白。多序列比对和进化分析表明, BnaPIF4蛋白与白菜、拟南芥、亚麻芥等PIF4蛋白高度同源。PIF4蛋白进化关系与物种进化关系一致,近缘物种中的PIF4蛋白在进化树中高度聚类,大量植物中可见PIF4蛋白重复且低等植物中分化程度明显低于高等植物中,表明PIF4蛋白是一个晚期进化事件且可能存在功能冗余。酵母杂交实验表明BnaPIF4与BnaBZR蛋白存在互作,但BnaPIF4不能与BnaBZR基因的启动子互作,表明BnaPIF4与BnaBZR在蛋白水平而非转录水平发生互作。湘油15号中BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因表达规律一致,BnaPIF4基因主要表达于油菜茎表皮、未成熟角果和叶中,在花和根中表达较低,且其表达随油菜生育进程逐渐降低。     

砷胁迫下甘蓝型油菜苗期根、下胚轴和鲜重的全基因组关联分析

油菜是修复土壤重金属污染的理想作物,为筛选甘蓝型油菜耐砷性的显著关联单核苷酸多态性位点及相关候选基因,本研究以140份不同来源的甘蓝型油菜自交系为材料,测定和利用油菜60KSNP芯片对正常和砷胁迫条件下的相对根长(RRL)、相对下胚轴长(RHL)和相对鲜重(RFW)进行了全基因组关联分析。结果表明,与RRL、RHL和RFW显著关联的SNP位点分别为15、20和35个,单个SNP位点表型贡献率分别介于13.31%～24.39%、18.04%～33.82%和20.19%～25.06%之间;其中在A02、A07和C02染色体上同时存在与RRL、RHL和RFW显著关联的LD区间。基于油菜基因组信息在LD区间内共筛选到61个可能与砷胁迫相关的候选基因,其中PHT3;3、PHT1;9、GST、OTC5、NRAMP1和ZIP12等与重金属吸收和转运相关。实时荧光定量PCR分析结果表明, PHT3;3和PHT1;9是与甘蓝型油菜砷离子吸收转运相关的重要候选基因。本研究结果对于甘蓝型油菜耐砷胁迫机理的研究、性状的改良具有重要参考价值。